食源性致病菌检测技术（11）

致泻性大肠埃希氏菌

    致泻性大肠埃希氏菌能使人类致病，监诊表现主要为严重腹泻，多数表现为败血症。根据血清型别、毒力和所致临床症状可分为产肠毒素性大肠埃希氏菌（ETEC）、肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）以及肠粘附性大肠埃希氏菌（EAEC）五类。 

1．常规分离鉴定技术：按照GB/T4789-2003方法进行

    酶联免疫法（ELISA）：应用O157：H7多克隆抗体包被酶标板，加入适当稀释与处理的粪便标本后，再与过氧化物酶标记的抗O157：H7抗体结合，加底物显色，此法可直接检测粪便中O157：H7大肠埃希氏菌抗原，结果与细菌培养法一致。 

    免疫磁珠分离法（IMS）：用免疫磁分离法检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157：H7。可提高了大肠杆菌O157：H7感染病例的检出率，与PCR符合率高。 

2．快速酶触反应：大肠埃希氏菌具β-葡萄糖醛酸酶，但以O157：H7为代表的肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）却不具此酶。 

    毒素及毒力因子检测：包括LT、ST、Hly、SLT、Stx、EaeA、VT、EAST等，过去多用动物或细胞培养测定，现可用其单抗以多种免疫学手段检出，也可用基因探针技术或PCR等分子生物学技术检测。同时检测Hly和SLT基因，能快速检测和鉴定EHEC菌株，并与EPEC区分开来。 

    基因探针和PCR技术：国内徐建烟根据溶血素hlyAB基因序列设计了鉴定EHEC的特异DNA探针，敏感性特异性达99%。Fortin将套式PCR技术和荧光探针技术相结合来检测O157，该方法不仅可以鉴定与O157抗血清有交叉反应的菌株，而且灵敏度高，可检测牛奶和苹果汁中102CFU/ml，的细菌，如果先进行6h增菌，可检测1CFU/ml的细菌。

基因芯片：Chizhikov将6个编码大肠杆菌细菌抗原和毒力的特异基因探针（EaeA，SltI，SltII，FliC，RfbE，IpaH）点样在玻片上，取多重PCR扩增产物与之杂交，用于同时检测和鉴定食物中毒相关的肠道病原体，该芯片可同时检测15种沙门菌、志贺菌和大肠杆菌的毒力因子。 

    细胞粘附试验：传统的细胞粘附试验是检测EIEC的标准方法。方法为在24孔板的孔中圆形玻片上培养的HEP-2细胞单层，生长致50%；待检菌以L肉汤培养，37℃，静止培养16h；每孔加入20ul菌液（含2×107个菌），置37℃，5%CO2温育3h，培养液中含1%α-甲基-D-甘露醇；Hank’s平衡盐溶液洗培养板3次；70%乙醇固定，10%Giema染色，取出圆形玻片，置载玻片上，油镜观察。 

3．分子流行病学分型方法

    血清型分型技术：包括O、K、H、F四种抗原。O抗原共171种，其中162种与腹泻有关，是分群的基础。K抗原103种。从病人新分离的大肠埃希氏菌多有K抗原。根据耐热性等不同，K抗原分为L、A、B三种，其中L、B不耐热，有60种。F抗原至少有5种，与大肠埃希氏菌的粘附作用有关。血清型的表示方式可按O：K：H排列，例如O：K：H如O111：K58（B4）：H2；O：K如O8：K88；O：H如O168：H27。 

    脉冲场电泳（PFGE）分型：用核糖体分型和脉冲肠电泳技术，对急性分泌型腹泻病人中分离的ETEC病原菌分析，血清型相同的ETEC菌株具有遗传异质性，不同血清型的ETEC菌株其PFEG型一致。美国国家公共卫生实验室已完成了PFGE的标准化流程的制定。 

    随机引物扩增DNA多态性（RAPD）和扩增片段长度多态性（FAFLP）分析分型技术：用随机扩增多态性DNA技术（RAPD）分析，发现具有相同表型特征的ETEC菌株，用分子生物学分型方法能揭示菌株间的差异，这些差异往往在不能在对ETEC的表型中显示出来。有学者认为FAFLP比PFGE具有更高的鉴定能力，扩增片段可精确到±1bp。

噬菌体分型：目前，通过对噬菌体感受性的不同，已获得80余种噬菌体型。

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