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在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略(六)



录入时间:2011-9-8 16:23:29 来源:生物在线

    分子伴侣
    目前已经达成共识,有效的蛋白质翻译后折叠、多肽装配成寡聚体结构以及蛋白质的转位都是由一种被称为分子伴侣的专职蛋白来介导的[200]。原核生物的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶在E.coli中的有效合成和装配需要GroES和GroEL蛋白的证据,使得利用分子伴侣在E.coli中进行基因高效表达成为近来研究的热点[201]。但是,利用分子伴侣所得到的实验结果并不一致,而且迄今为止,伴侣分子的共表达对基因表达的影响似乎都具有蛋白质特异性[202]。目前尚不清楚在基因过度表达的情况下,分子伴侣的体内水平是否受到限制。正常情况下,蛋白质的折叠最终达到一种热力学的稳定状态。特别不稳定的蛋白即使在伴侣分子存在的情况下,或许也不能正确折叠。因此,多肽链的截断、多亚基蛋白复合物单个结构域的产生、缺乏维持蛋白质正常结构的二硫键的形成以及缺乏翻译后的修饰如糖基化等,都将不可能达到热力学的稳定状态。现在已经明白不同类型的伴侣分子正常情况下是协同发挥作用的[203]。因此,只过度表达单一的伴侣分子可能不太有效。在某些情况下,共表达与靶蛋白来源相同的伴侣分子可能是必要的。还有一个需要考虑的变量是培养温度。例如,在30℃时GroES-GroEL共表达能够提高β-半乳糖苷酶的产量,而在37℃或42℃则不能[204]。最后,伴侣分子的共表达有可能导致表型的改变如细菌丝状生长,这有可能对细菌的生存和蛋白质的产生不利[205]。最近有报道表明,将人或鼠的蛋白质二硫键异构酶(PDI)与靶基因共表达,能提高在E.coli细胞质中正确折叠蛋白质的产量[206,207]E.coli细胞质中二硫键的形成是由维持氧化还原电势的一组蛋白质来促进的[208]。有人认为DsbA(一种可溶性的细胞外周质蛋白)直接催化蛋白质中二硫键的形成,而DsbB(一种内膜蛋白)则参与DsbA的再氧化。真核生物的PDI能够补充dsbA缺失突变株的表型,但其功能在dsbB突变株中完全丧失。另外,通过额外添加谷胱甘肽可以提高PDI增强靶蛋白产生的能力。这些证据表明,PDI有赖于细菌氧还蛋白来完成自身的再氧化[207]
 
     培养条件
     E.coli中的蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统而获得显著提高。高细胞密度培养系统可以分成三类:分批培养、补料分批培养和连续培养。这些方法能获得超过100g/升的细胞浓度,从而获得廉价的重组蛋白。有关大规模培养系统的资料已有详细的综述[193,209]。培养基的组成需要仔细地计算和监控,因为这对细胞和蛋白质的产生具有重要的代谢效应。例如,不同mRNA的翻译可以因温度和培养基的变化而受到不同程度的影响[210]。营养成分和培养参数如pH、温度和其他参数都会影响蛋白酶的活性、分泌和产量[211]。已经证明对培养基的特殊操作能明显提高蛋白质释放到培养基中。例如,在培养基中添加甘氨酸能增强外周质蛋白释放到培养基中,且不引起明显的细菌裂解[212,213]。同样,在山梨糖醇和甘氨酰甜菜碱存在的渗透压力下培养细菌,可以使可溶性的活性蛋白产量提高多达400倍[139]
高细胞密度培养系统也有其自身的缺陷。这些缺陷包括在高细胞密度情况下,溶解氧的量有限;二氧化碳水平能够降低生长速度、刺激乙酸形成降低发酵罐的混合效率和产热等。有关这些问题的解决方案已经有详细的介绍[193]。利用高细胞密度培养系统生产重组蛋白质的一个主要问题是乙酸的积累,这种亲脂性成分对细胞的生长是有害的[193]。虽然有多种解决这一问题的方案,但是均各有缺点。近来这一问题通过将来自B. subtilis编码醋酸盐合成酶的alsS基因导入E.coli细胞中得以解决[141]。该酶催化丙酮酸转化为非酸性和低毒性的副产品。乙酸积累的减少极大地改善了重组蛋白的产生。另外,其他酶缺陷的E.coli突变株也已经建立,这些突变株产生较少的乙酸,从而提高了人重组蛋白的表达水平[214]

 

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