中量提取质粒DNA（CsCl 密度梯度离心法）

中量提取质粒DNA（CsCl 密度梯度离心法）
李渊越
1. 将菌液倒入装有 50mL TB 的锥形瓶中，或从培养好的平板上挑取单克隆，锥形瓶置于37℃摇床
350rpm 培养16-20h,至OD600 到10-12。（OD600 到40 为用TBS 培养基在我们的培养条件下所能达到的最高浓度，
在此浓度时，菌处于对数生长期）
2. 将培养好的菌液到入国产 50mL 离心管中，每管不超过45mL。（有实验表明，若往离心管中装入超过45mL 的
液体，离心后，液体的终体积仍为45mL。因此，一次不应离超过45mL 的液体，否则将污染离心机。）
3. 室温离心 5,000rpm，5min。弃上清，控干。
4. 加 P1-RNase 至终体积到7mL，震荡重悬至菌均匀分散。（按该法最多只能裂解45mL 13OD 的细菌，如需裂解更
多细菌，请按比例增加。否则将导致细菌裂解不完全，反而提到更少的菌。）
5. 加 14mL P2，盖上盖子，上下颠倒混匀2min。（该步一定要混匀，以达到将细菌完全裂解的目的。加入P2 后可见溶
液澄清粘稠，该步反应时间不应过久）
6. 加 7mL P3。（P2 和P3 之间反应时间不要超过5min。混匀后可见絮状沉淀。该步若置于冰上，沉淀效果更好。但位于室温的反应
以足以达到实验需要。）用H2O 配平至对称管重量差<0.1g。
7. 室温（4 度更好，但没有必要。）离心，10,000 rpm, 5min。
8. 将上清用滤纸过滤至另一国产的 50mL 管中。加0.6 倍体积的异丙醇，颠倒混匀后室温（不可置于
4 度。若置于4 度，将会使部分盐析出）静置10min。（分子克隆p35）
9. 室温离心 10,000rpm 15min。
10. 弃上清，在加 1.8mL H2O 溶解完全后，平均分至两个1.5mL 管中，再分别往每管中加入二分之
一体积的PEG8000，4C 沉淀2 小时。
11. 3,000 rcf 离心3min，弃上清。（可以不要非常完全控干）
12. 加 1.55mL CsCl 溶液溶解至沉淀完全溶解。10,000 rcf 3min 离心，弃去不溶物质。
13. 往 2mL 超速离心管中加入50ul 2mg/mL EB。加之前用卷纸把枪头外壁的EB 擦干。（将外壁的EB 擦干
是为了防止EB 残留在离心管的管口。）
14. 将 DNA 移至2mL 超速离心管中,并用H2O 将体积补至2mL。（此时，溶液的密度为3.10g/2mL，共含1.55g CsCl。）
15. 配平至对称管重量差<0.02g，封口。（该步配平时，可按1ulH2O 重0.001g 来补加H2O 进行配平以缩短时间。）在封口
后，上下颠倒混匀。
16. 打开超速离心机，按 Memu -> Programme -> Plasmid-CsCl -> OK。（该步为149,000rpm 2h 升速max 降速
6。）
17. 按 Vacuum 至真空度<400 后按 Start。（不等真空度至<400 其实也可启动，但这可能将造成离心机反复升降速，故制
定此规则。）等升至最大转速后才能离开。（该步为离心机安全操作必须，请务必做到。）
18. 2h 后，取出转头，离心管。若转头内有液体需将其洗净，擦干。（因为此时泄漏的液体含有EB，因此需要
将其洗净，擦干。）
19. 先用 8 号针头在离心管上部插个洞，再用1mL 注射器抽出所需的红色DNA 条带至1.5mL 离心管
中。
20. 加入 1mL 水饱和正丁醇，上下颠倒混匀（勿用振荡器）约20 下。（或更多，使上部液体尽可能变红。）将
1.5mL 管置于离心机中，按Short 键 5 秒，松手。弃去上层液体。（离心的目的是为了加速液面分层，因此
也可省去。）
21. 重复 20 步2-3 遍，至下层看不到红色后再萃取一遍。（再萃取一遍的目的是为了确保EB 完全去除。）
22. 往溶液中补加等体积的 H2O，平均分成若干管，使每管终体积为400ul。往每管中分别加入1mL(2.5
倍体积)无水乙醇，颠倒混匀。13,500 rpm 5min 4C。弃上清。（该步的目的是为了除去溶液中残留的CsCl。）
23. 加 1mL 预冷的70%乙醇洗一遍。13,500 rpm 5min 4C。弃上清。（该步的目的是为了除去21 步中管壁上残留
的部分含CsCl 的液体。）
24. 加 400ul H2O 或TE 溶解。（对于高拷贝质粒，45mL 菌液将获得500-1,500ug 左右质粒。）
中量提取质粒DNA（CsCl 密度梯度离心法）
试剂
P1
50mL P1+5mg RNase，4C 保存。
P2
P3
异丙醇
PEG8000
CsCl 溶液
准确称取31.00gCsCl，加H2O 定容至30.0mL。
2mg/mL EB
水饱和正丁醇
无水乙醇
70%乙醇

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