质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测（下）

二、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳技术（Agarosegelelectroghoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。

【材料】
      1、琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液（40mMTris,20mMNaAc,1mMEDTA，PH8.0）
      2、载体缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）、溴化乙锭水溶液（10mg/ml）
      3、凝胶槽、电泳仪

【方法】

1、取琼脂糖0.9g，加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，100℃加热溶解。

2、平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5~1mm）。

3、铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至500C左右倒入凝胶槽，胶厚一般为5~8mm。

4、待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2~3mm，小心拔出梳子。

5、DNA样品与载体缓冲液5：1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）。

6、打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm。

7、据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的涌动距离在5sRNA和0.3kbDNA带之间）。

8、电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。

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