【摘要】 目的 ：从环境中分离高产脂肪酶的细菌，并克隆其脂肪酶基因。方法：从天然高油脂含量土壤筛选高产脂肪酶的细菌，鉴定菌种后，设计相应引物PCR扩增脂肪酶基因并进行TA克隆，重组载体转入E.coli DH5α构建工程菌，双酶切及测序鉴定脂肪酶基因。结果：经过微生物菌种鉴定获得4株高活力菌，其中一株金葡菌产酶最高，利用PCR技术成功扩增脂肪酶基因，该基因经过克隆测序及其双酶切鉴定证实为新发现的突变脂肪酶基因，其二级结构与标准基因(EU310372)有较大不同。结论：成功分离一株高产脂肪酶的菌株——金黄色葡萄球菌，克隆的脂肪酶基因为新发现的突变型。
【关键词】 脂肪酶基因；PCR；TA克隆
Abstract: Objective: To separate natural bacteria producing high activities lipase from environment，and clone its lipase gene. Methods: High activities lipase producing bacteria was screened from soil which contained plenty of oils and fats. After identifying bacteria，PCR amplified lipase gene which was cloned to pMD18-T Vector. The recombint plasmid was transformed into E. Coli DH5αto build the engineering bacteria. At last，the lipase gene was identified with two restriction endonuclease digesting and sequencing. Results: After identifiying，4 producing high activitie lipases bacteria strains were obtained，one of which was a Staphylococcus aureus producing highest activities lipase，its lipase gene was amplified by PCR，then separated and identified as a new mutant lipase gene by restriction endonuclease digesting and sequencing. standard lipase gene registered on NCBI (EU310372)，The secondary structure of the new mutant lipase gene was more different from standard lipase. Conclusion: A strain of high activities lipase producing bacteria-Staphylococcus aureus is successfully isolated and the cloned lipase gene is a new discovered mutant type.
Key words: lipase gene；PCR；TA cloning
脂肪酶是一类酯键水解酶，广泛存在于微生物、植物种子及动物组织中，能在油水界面上催化脂类物质分解、合成和酯交换反应。作为重要的工业用酶，脂肪酶在医药、食品、制革、饲料、洗涤、油酯化工等传统工业领域有着广泛的应用，如可添加在洗涤剂增加去油脂能力，添加在高脂食物以增加口感，而近年来其在生物能源、有机合成、药物手性拆分和工具酶等新领域也展现了良好的应用前景[1]。以上领域应用的脂肪酶，或为天然菌分离或为基因重组来源，但其微生物来源脂肪酶应用最广泛[2-5]。据统计，细菌有28个属，放线菌有4个属，酵母菌有10个属，其他真菌有23个属，共计达65个属的微生物产脂肪酶。而动物脂肪酶、植物脂肪酶由于其作用底物谱窄，体外表达活性、产量低，该类基因很少作为基因工程的脂肪酶来源基因[6-8]。
本课题拟通过从高含油脂的环境中分离到产高活力脂肪酶的微生物并克隆高活力脂肪酶基因，为后续的获得工程菌清除高油脂污水、获得较高活力脂肪酶基因并通过基因工程获得高活力、高产量的重组脂肪酶研究打下一定基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
E.coli DH5α由温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室提供；限制性内切酶Ndel，Hind III，NcoI，XhoI，pMD-18 T vector，T4连接酶、Tag DNA聚合酶、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0）、基因组提取试剂盒，均购自宝生物工程有限公司；橄榄油、聚乙烯醇（PVA）、溴甲酚紫购自上海三爱思试剂有限公司。
1.2 产脂肪酶天然菌株的筛选及鉴定
产脂肪酶细菌主要从自然界中筛选，采集温州汽车站，茶山镇及温州医学院茶山校区周围的油污丰富的土壤，供分离使用。共采集到土壤样品14份(包括:河道污泥、餐厅厨房清洗处污泥、菜市场肉案上木屑、修车店门前污泥、饮食店油烟机油渍等)。筛选方法是：样品经富集培养、平板初筛(观察变色圈大小)，最后经摇瓶复筛(测酶活力大小)，具体的配方及操作参照文献[9]。将分离到的菌株用法国梅里埃微生物鉴定仪鉴定，然后进行酶活测定。
1.3 天然菌基因组提取的优化
运用了试剂盒法、酚-氯仿法、煮沸法三种方法分别提取金黄色葡萄球菌全基因组，并经PCR扩增脂肪酶基因[10]，比较三种方法的优缺点，为后续实验提供一定的基础。
1.4 脂肪酶基因的克隆
根据NCBI上公布的一些常见的细菌脂肪酶基因设计了8对通用引物（见表1）。
用8对引物分别对分离出的菌株进行脂肪酶基因的扩增。PCR反应条件I为：94 ℃预变性5 min，再循环30次：94 ℃变性55 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸150 s，最后1个循环72 ℃延伸10 min，适用于引物3、5、8的扩增。PCR反应条件II为：94 ℃预变性5 min，再循环30次：94 ℃变性55 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，最后1个循环72 ℃延伸10 min，适用于引物1、2、4、6、7的扩增。PCR反应体系为50μL体系。PCR产物用经试剂盒纯化，用T4连接酶于与pMD18-T Vector，16 ℃连接2 h后，转化感受态E.coli DH5α细菌，再将少许菌液涂布在含有X-Gal，IPTG，Amp的L-琼脂平板培养基上培养，进行蓝白斑筛选验证试验。
1.5 pMD18-T Vector重组载体鉴定
挑取上步骤中单个白色菌落扩大培养，提取质粒[11]，双酶切电泳鉴定。同时将单个白色菌落的菌液送上海生工测序。
1.6 脂肪酶测序分析及二级结构预测分析
运用软件CodonCode Aligner分析测序结果，SPSS 11.0统计学软件对其进行统计分析，通过在线免费软件PredictProtein分别对人工分离到的金葡菌脂肪酶和NCBI上注册号EU310372脂肪酶进行二级结构预测分析[12]。
