陈香露白露片微生物限度检查方法验证研究

【摘要】  　　目的：建立陈香露白露片微生物限度检查方法。方法：根据该样品的微生物限度标准，按《中国药典》2005年版一部附录微生物限度检查法的验证试验指导原则，用委托厂家3个批号的陈香露白露片进行验证试验，以考察确定陈香露白露片微生物限度的检查方法。首先用常规法进行预试验，初步考察该样品对试验菌检测的影响，然后根据预试验结果，用离心沉淀集菌法进行再试验。结果：常规法试验时，大肠埃希菌、白色念珠菌的回收率均大于70%，而金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率小于70%，控制菌检查检出试验菌。采用离心沉淀集菌法试验时，可以有效消除抑菌作用，使金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率大于70%。结论：采用离心沉淀集菌法可以有效消除抑菌作用，简便、准确。

【关键词】  微生物限度检查 验证试验 离心沉淀集菌法

陈香露白露片是一复方中成药制剂，由川木香、大黄、石菖蒲、陈皮、甘草、次硝酸铋、氧化镁、碳酸氢钠组成，用于胃溃疡、糜烂性胃炎、胃酸过多等疾病［1］。《中国药典》2005年版规定，在进行药品微生物限度检查时，应对所用方法进行验证，以确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。为此，笔者对陈香露白露片的微生物限度检查方法进行了验证试验。

　　1  试验材料

　　1.1  样品
   
　　陈香露白露片（云南龙发制药有限公司；规格：100片/瓶；批号：060401、060402、060403）。

　　1.2  稀释剂及培养基
   
　　pH 7.0无菌氯化钠�驳鞍纂嘶撼逡骸�0.9%无菌氯化钠溶液、TTC营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、MUG培养基、胆盐乳糖发酵培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基。

　　1.3  菌种
   
　　金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、大肠埃希菌［CMCC（B）44102］、枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］，均来源于云南省食品药品检验所。

　　2  验证试验

　　2.1  试验菌液的制备
   
　　接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，置30～35 ℃培养18～24 h，分别取上述培养物 1 mL，加0.9%无菌氯化钠溶液 9 mL，10倍递增稀释，取稀释液1 mL，加入到1个平皿中，每种菌的每1个稀释级平行制备2个平皿，倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养24～48 h，计数，选择每1 mL含菌数为50～100 cfu的稀释级菌悬液，作为验证试验用菌悬液。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，置23～28 ℃培养24～48 h，取上述培养物1 mL，加0.9%无菌氯化钠溶液9 mL，10倍递增稀释，取稀释液1 mL，加入到1个平皿中，每1个稀释级平行制备2个平皿，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23～28 ℃培养72 h，计数，选择每毫升含菌数为50～100 cfu的稀释级菌悬液，作为验证试验用菌悬液。

　　2.2  供试液的制备
   
　　从两瓶样品中取样品10 g，至灭菌匀浆杯中，加pH 7.0无菌氯化钠�驳鞍纂嘶撼逡褐�100 mL，经匀浆仪混匀，制成1∶10的供试液。陈香露白露片3个批号样品同法操作。

　　2.3  细菌数、霉菌及酵母菌数计数方法的验证

　　2.3.1  预试验（常规法）
   
　　（1）试验组：取1∶10的供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备8个平皿，依次加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），每种菌平行制备2个平皿；取1∶100的供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备8个平皿，依次加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），每种菌平行制备2个平皿；取1∶1 000的供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备8个平皿，依次加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），每种菌平行制备2个平皿。含大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的试验平皿倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数；白色念珠菌的试验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23～28 ℃培养72 h，计数。
   
　　（2）菌液组：分别取已制备好的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），加入到1个平皿中，每种菌平行制备2个平皿。含金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的试验平皿倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数；白色念珠菌的试验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23～28 ℃培养72 h，计数。
   
　　（3）供试品对照组：取1∶10供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备4个平皿。取1∶100供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备4个平皿。取1∶1 000的供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备4个平皿。每一稀释级中的2个平皿倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数；每一稀释级中的另2个平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23～28 ℃培养72 h，计数。
   
　　（4）试验组菌回收率计算：菌回收率（%）=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）∕菌液组平均菌落数。
   
　　（5）结果：见表1。大肠埃希菌、白色念珠菌在样品的1∶10、1∶100、1∶1 000供试液中回收率均大于70%；金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在样品的1∶1 000供试液中回收率均大于70%，在样品的1∶10、1∶100供试液中回收率均小于70%。根据上述情况，笔者采用离心沉淀集菌法进行再试验。

    2.3.2  再试验（离心沉淀集菌法）
   
　　（1）试验组：从100 mL的1∶10供试液中取上清液10 mL，3 000 r/min离心20 min，弃去上清液，留底部集菌液约2 mL，加pH 7.0无菌氯化钠�驳鞍纂嘶撼逡翰怪�10 mL，混匀。取其1 mL加入到1个平皿中，同法制备4个平皿，依次加入金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），每种菌平行制备2个平皿。另取其1 mL，加入到9 mL pH 7.0无菌氯化钠�驳鞍纂嘶撼逡褐校�混匀，即为1∶100供试液。取1∶100供试液1 mL加入到1个平皿中，同法制备4个平皿，依次加入金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液l mL（含50～100 cfu），每种菌平行制备2个平皿。在制备好的平皿中倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数。
   
　　（2）菌液组：分别取已制备好的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），加入到1个平皿中，每种菌平行制备2个平皿，倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数。
   
　　（3）供试品对照组：取1∶10供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备2个平皿。取1∶100供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备2个平皿。同法制备4个平皿。倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数。
   
　　（4）试验组菌回收率计算：菌回收率（%）=（试验组平均菌落数﹣供试品对照组平均菌落数）∕菌液组平均菌落数
   
　　（5）结果：见表2。采用离心沉淀集菌法后，可去除供试液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌作用，使菌回收率大于70%。

　　2.4  控制菌检查方法的验证

　　2.4.1  大肠埃希菌检查方法的验证
   
　　（1）试验组：取1∶10供试液10 mL和大肠埃希菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），加入到胆盐乳糖增菌液100 mL中，置35～37 ℃培养18～24 h，按《中国药典》2005年版一部附录微生物限度检查法中的大肠埃希菌检查法进行检查。
   
　　（2）阴性对照组：取1∶10供试液10 mL和金黄色葡萄球菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），加入到胆盐乳糖增菌液100 mL中，置35～37 ℃培养18～24 h，按《中国药典》2005年版一部附录微生物限度检查法中的大肠埃希菌检查法进行检查。
   
　　（3）供试品对照组：取1∶10供试液10 mL，加入到胆盐乳糖增菌液100 mL中，置35～37 ℃培养18～24 h，按《中国药典》2005年版一部附录微生物限度检查法中的大肠埃希菌检查法进行检查。
   
　　（4）结果：试验组检出大肠埃希菌，阴性菌对照组结果为阴性，供试品对照组未检出大肠埃希菌。

　　2.4.2  大肠菌群检查方法的验证
   
　　（1）试验组：取1∶10、1∶100、1∶1 000供试液各1 mL和大肠埃希菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），加入到3支胆盐乳糖发酵培养液中，置35～37 ℃培养18～24 h，按《中国药典》2005年版一部附录微生物限度检查法中的大肠菌群检查法进行检查。
   
　　（2）阴性对照组：取1∶10、1∶100、1∶1 000供试液各1 mL和金黄色葡萄球菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），加入到3支胆盐乳糖发酵培养液中，置35～37 ℃培养18～24 h，按《中国药典》2005版一部附录微生物限度检查法中的大肠菌群检查法进行检查。
   
　　（3）供试品对照组：取1∶10、1∶100、1∶1 000供试液各1 mL，加入到3支胆盐乳糖发酵培养液中，置35～37 ℃培养18～24 h，按《中国药典》2005版一部附录微生物限度检查法中的大肠菌群检查法进行检查。
   
　　（4）结果：试验组检出大肠菌群，阴性菌对照组结果为阴性，供试品对照组未检出大肠菌群。

　　3  讨论
   
　　采用常规法试验时，该样品对大肠埃希菌、白色念珠菌的加菌回收率均大于70%，证明其对上述2种供试菌无抑菌作用。该样品对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑菌作用，在1∶10、1∶100的稀释级，其加菌回收率小于70%，低于《中国药典》2005年版规定的回收率不得低于70%才视为无抑菌作用的要求。结合该样品的物理特性和常规法试验结果，采用离心沉淀集菌法进行试验后，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的加菌回收率可大于70%。故陈香露白露片的细菌数检查可采用离心沉淀集菌法，霉菌及酵母菌数的检查采用常规法。
   
　　由控制菌检查方法的验证试验结果表明，采用常规法试验时，该样品对大肠埃希菌、大肠菌群的检查无干扰，故陈香露白露片的控制菌检查可采用常规法。
   
　　因安全原因，黑曲霉［CMCC（F）98003］的验证试验未进行。

【参考文献】
  　　［1］ 卫生部药典委员会. 卫生部药品标准. 中药成方制剂(第八册)［S］. 北京： 人民卫生出版社， 1993: 87.

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