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【论文关键词】土霉素片；微生物限度检查法
【论文摘要】目的：建立土霉素片的微生物限度检查方法。 方法：采用薄膜过滤法对土霉素片处理后，分别进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。结果：金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率均大于70%。结论：土霉素片采用薄膜过滤法检查微生物限度方法成立。
土霉素是四环素类抗生素，能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位结合，抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成，对细菌有广谱抑菌作用。因此其微生物限度检查不能用平皿法，而应采用薄膜过滤法消除其抑菌作用后再检查。
1 材料
1.1 仪器：HWS-250型恒温恒湿箱（天津苏瑞科技开发有限公司），集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司），薄膜（孔径0．22um），康氏振荡器。
1.2 试剂：玫瑰红钠琼脂培养基，营养琼脂培养基，胆盐乳糖增菌培养基，MUG培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基等，均由中国药品生物制品检定所提供。
1.3 菌种：阳性对照菌：金黄色葡萄球菌（验证细菌）、白色念珠菌（验证酵母菌、霉菌）；阴性对照：金黄色葡萄球菌（验证大肠埃希菌）。所用菌种均由中国药品生物制品检定所提供；稀释剂及冲洗剂为pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。
1.4 样品：土霉素片［0.25g（25万单位）］，厂家为河南华利药业有限责任公司，批号为07070601。
2 方法与结果
2.1 细菌、霉菌、酵母菌检查方法验证。
2.1.1 细菌检测方法验证。
2.1.1.1 试验组：取供试品10g，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，于康氏振荡器上振摇10分钟，使片分散，500转、分离心后，分离上清液作为供试液。取上述供试液10ml，加入100ml稀释剂中，薄膜过滤，用冲洗液冲洗2次，每次100ml，第3次冲洗液中加入金黄色葡萄球菌菌悬液0.5ml，薄膜过滤，取出滤膜，面朝上贴于营养琼脂平皿上，35℃培养48小时，计数。
2.1.1.2 菌液组：取金黄色葡萄球菌菌悬液0.5ml,直接接种于营养琼脂平皿上，35℃培养48小时，计数。
2.1.1.3 供试品对照组：取上述供试液10ml,加入100ml稀释剂中，薄膜过滤，用冲洗液冲洗3次，每次100ml，取出滤膜，面朝上贴于营养琼脂平皿上，35℃培养48小时，计数。
2.1.1.4 稀释剂对照组：取稀释液10ml,薄膜过滤，用冲洗液冲洗2次，每次100ml,第3次冲洗液中加入0.5ml金黄色葡萄球菌菌悬液，薄膜过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂平皿上，35℃培养48小时，计数。
2.1.1.5 上述试验连续做三次，结果如下：
金黄色葡萄球菌计数后平均值：
稀释剂对照组菌数：第一次47个，第二次53个，第三次49个；
菌液组菌数：第一次58个，第二次64个，第三次60个；
试验组菌数：第一次45个，第二次54个，第三次46个；
供试品对照组菌数：第一次0个，第二次0个，第三次0个。
2.1.1.6 计算金黄色葡萄球菌回收率。
2.1.1.6.1 稀释剂对照组的回收率:(稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数)×100%
第一次：47/58×100%=81.0%
第二次: 53/64×100%=82.8%
第三次: 49/60×100%=81.7%
2.1.1.6.2 试验组的回收率:
[(试验组的平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数]×100%
第一次：（45-0）/58×100%=77.6%
第二次:（54-0）/64×100%=84.4%
第三次:（46-0）/60×100%=76.7%
2.1.2 霉菌、酵母菌检查方法验证。
2.1.2.1 试验组：取供试品10g，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，于康氏振荡器上振摇10分钟，使片分散，500转、分离心后，分离上清液作为供试液。取上述供试液10ml，加入100ml稀释剂中，薄膜过滤，用冲洗液冲洗2次，每次100ml，第3次冲洗液中加入白色念珠菌菌悬液0.5ml，薄膜过滤，取出滤膜，面朝上贴于营养琼脂平皿上，23℃培养72小时，计数。
2.1.2.2 菌液组：取白色念珠菌菌悬液0.5ml,直接接种于营养琼脂平皿上，23℃培养72小时，计数。
2.1.2.3 供试品对照组：取上述供试液10ml,加入100ml稀释剂中，薄膜过滤，用冲洗液冲洗3次，每次100ml，取出滤膜，面朝上贴于营养琼脂平皿上，23℃培养72小时，计数。
2.1.2.4 稀释剂对照组：取稀释液10ml,薄膜过滤，用冲洗液冲洗2次，每次100ml,第三次冲洗液中加入0.5ml白色念珠菌菌悬液，薄膜过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂平皿上，23℃培养72小时，计数。
2.1.2.5 上述试验连续做三次，结果如下：
白色念珠菌计数后平均值：
稀释剂对照组菌数：第一次56个，第二次60个，第三次53个；
菌液组菌数：第一次45个，第二次47个，第三次42个；
试验组菌数：第一次43个，第二次45个，第三次44个；
供试品对照组菌数：第一次0个，第二次0个，第三次0个。
2.1.2.6 计算白色念珠菌的回收率。
2.1.2.6.1 稀释剂对照组的回收率:
(稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数)×100%
第一次：45/56×100%=80.4%
第二次: 47/60×100%=78.3%
第三次: 42/53×100%=78.2%
2.1.2.6.2 试验组的回收率:
[(试验组的平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数]×100%
第一次：（43-0）/56×100%=76.8%
第二次:（45-0）/60×100%=75.0%
第三次:（44-0）/53×100%=83.0%
2.2 大肠埃希菌检测方法验证。
2.2.1 试验组：取供试品10g，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，于康氏振荡器上振摇10分钟，使片分散，500转/分离心后，分离上清液作为供试液。取上述供试液10ml，加入100ml稀释剂中，薄膜过滤，用冲洗液冲洗2次，每次100ml，第三次冲洗液中加入大肠埃希菌菌悬液0.2ml，薄膜过滤，取出滤膜，放入100ml胆盐乳糖培养基中, 35℃培养24小时,取0.2ml上述培养物加入5ml MUG培养基中,24小时后,加靛基质试液5滴,液面呈现玫瑰红环。
2.2.2 阴性菌对照组：照上述方法操作，第三次冲洗时冲洗液中加入2ml金黄色葡萄球菌菌液，薄膜过滤，取出滤膜加入100ml胆盐乳糖培养基中，于35℃培养24小时，再取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，于35℃培养24小时，未发现有金黄色葡萄球菌典型菌落。
3 讨论
3.1 在细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证三次平行试验中，稀释剂对照菌回收率均不低于70%，试验组的菌回收率均不低于70%，照薄膜过滤法可进行土霉素片的细菌、霉菌及酵母菌的检查。
3.2 通过大肠埃希菌检测方法验证，阴性对照组未检出金黄色葡萄球菌，试验组检出大肠埃希菌，按薄膜过滤法可进行土霉素片的大肠埃希菌检查。
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