消痛贴膏微生物限度检查方法的建立

【摘要】  　　目的建立消痛贴膏微生物限度检查方法。方法参照《中国药典》2005年版微生物限度检查方法，采用常规法和培养基稀释法进行该药品的微生物方法学验证。结果采用常规法时，白色念珠菌、黑曲霉的菌回收率均高于70 %，采用培养基稀释法（0.2 ml/皿）时，金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌的菌回收率均高于70 %；细菌计数可用培养基稀释法（0.2 ml/皿），霉菌和酵母菌计数可用常规法，控制菌铜绿假单胞菌可用常规法检查，金黄色葡萄球菌可用200 ml培养基稀释法检查。结论该法能有效地消除药品中抑菌物质的干扰，检出率高。

【关键词】  微生物限度检查法； 方法学验证； 消痛贴膏； 回收率

　　消痛贴膏是藏药外用贴膏剂，其功能主治为活血化淤、消肿止痛，用于治疗急慢性扭挫伤、跌打淤痛、骨质增生、风湿及类风湿疼痛、落枕、肩周炎等。其主要成分为姜黄、花椒、水柏枝、独一味、棘豆等，其辅助药物润湿剂的主要成分为冰片、樟脑、乙醇等。按照《中国药典》2005年版要求［1］，笔者进行了消痛贴膏微生物限度检查方法的验证实验。由于该药品的剂型独特，用药时将润湿剂加至药芯上，二者结合体直接接触患者皮肤，并起到药效作用，所以在实验中以润湿剂加至药芯后的结合体作为验证对象。实验中发现，由于此药物处方中有姜黄、花椒、冰片、樟脑、乙醇等，均含有抑菌性，对于某些细菌的生长繁殖有一定的抑制作用，所以采用常规法、培养基稀释法，以消除抑菌成分的干扰，并探讨该法检出药品中污染存活的细菌数量的有效性。

　　1  器材

　　1.1  菌种枯草杆菌［CMCC（B）63501］、大肠埃希菌［CMCC（B）44102］、金黄色葡萄球菌 ［CMCC（B）26003］、铜绿假单胞菌［CMCC（B）10104］、黑曲霉［CMCC(F)98003］、白色念珠菌［CMCC (F) 98001］。

　　1.2   培养基试剂胆盐乳糖培养基；营养肉汤培养基；营养琼脂培养基；玫瑰红钠琼脂培养基；蛋白胨；真菌琼脂培养基；（中国药品生物制品检定所）。

　　1.3  试药消痛贴膏（奇正藏药集团，批号分别为：051073、051074、051178。）

　　1.4  仪器隔水式电热恒温培养箱(型号:PYX-DHS,上海跃进医疗器械厂生产)；霉菌培养箱(型号:MJX-190-Ⅱ,广东省医疗器械厂生产)；电热恒温干燥箱(型号:DHG-9077,上海精宏实验设备有限公司生产)；全自动高压蒸气灭菌锅(型号:LDZX-40SBI,上海申安医疗器械厂生产)；净化工作台(型号:SW-CJ-2F,苏州净化设备有限公司生产)。

　　2  方法

　　2.1  菌液制备接种金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物于营养肉汤培养基中, 30～35℃培养18～24 h；接种白色念珠菌的新鲜培养物于改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48 h,上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至50～100 cfu/ml。接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁培养基斜面，培养5～7 d，加入5 ml 0.9%无菌氯化钠溶液，洗下霉菌孢子，吸取孢子菌悬液1 ml，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-4（含孢子数为50～100 cfu/ml）。

　　2.2  供试品的处理取2贴，揭除瓦楞膜，将润湿剂加至药芯表面后剪碎（相当于10 g），加至pH 7.0的100 ml氯化钠-蛋白胨缓冲液中，45℃水浴15 min，作为1∶10备用液。

　　2.3  菌回收率测定

　　2.3.1  试验组供试液1 ml与50～100 cfu验证用菌株加入平皿中，立即倾注相应的琼脂培养基，培养、计数。

　　2.3.2  菌液组测定所加验证菌株的菌数，即50～100 cfu验证用菌株加入平皿中，培养基注皿，培养、计数。

　　2.3.3  供试液对照组分别取与试验组中等量的供试液注皿，立即倾注相应的琼脂培养基，培养、计数。
   
　　菌回收率（%）=（试验组平均菌落数-供试液对照组平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100 %

    2.4  细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证［1］

　　2.4.1  常规法取“2.2”项中制备的供试液1 ml加15～20 ml菌落计数用琼脂培养基注皿，混匀凝固后，倒置，细菌置30～35℃培养24～48 h，霉菌置23～28℃培养48～72 h；计数,测定菌回收率。 

　　2.4.2  培养基稀释法 取“2.2”项中制备的供试液1 ml，按0.2 ml/皿加样,再加15～20 ml菌落计数用琼脂培养基注皿，相应温度培养计数，测定菌回收率。

　　2.5  控制菌检查方法验证

　　2.5.1  常规法分别取“2.2”项中制备的供试液各10 ml，10～100 cfu铜绿假单胞菌和10～100 cfu金黄色葡萄球菌分别加至100 ml胆盐乳糖和100 ml营养肉汤增菌液中，按《中国药典》2005年版微生物限度检查方法中控制菌检验方法进行菌回收实验［1］。

　　2.5.2  培养基稀释法取“2.2”项中制备的供试液10 ml，10～100 cfu金黄色葡萄球菌加至200 ml营养肉汤增菌液中，按《中国药典》2005年版微生物限度检查方法中控制菌检验方法进行菌回收实验［1］。

　　3  结果
   
　　验证结果见表1～3。

　　表1  常规法验证（略）

　　表1结果表明：人工污染5株代表菌株，供试液对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有一定的抑菌性；对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉无抑菌性。说明细菌计数不能采用常规法，霉菌及酵母菌计数可采用常规法。

　　表2  培养基稀释法验证（略）

　　表2结果表明：采用培养基稀释法（0.2 ml/皿）可消除供试液对人工污染金黄色葡萄球菌、枯草杆菌的抑菌作用，回收率超过70 %，因此培养基稀释法（0.2 ml/皿）可用于细菌计数。
   
　　表3结果表明：铜绿假单胞菌验证法采用常规法（100 ml胆盐乳糖增菌液）；金黄色葡萄球菌验证法采用培养基稀释法（200 ml营养肉汤增菌液）。

　　4  讨论
   
　　本实验建立了消痛贴膏的微生物限度检查方法，该法消除了药品中抑菌物质的干扰，能真实准确地反映出药品中污染存活的细菌数，检出率高。

　　表3  控制菌验证（略）

　　菌液制备中50～100 cfu菌数较难控制［2，3］，笔者认为验证过程中可用此方式控制菌数，即金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌的菌原液稀释至10-6、枯草杆菌、黑曲霉的菌原液稀释至10-5，依据菌原液的浊度，吸取不同体积（0.5～1 ml之间）的稀释液（共取2～3个点）,作为验证实验中的菌液组，这样能增加回收率实验中所加菌液数在有效值范围内的几率，提高实验效率。

  　　目的建立消痛贴膏微生物限度检查方法。方法参照《中国药典》2005年版微生物限度检查方法，采用常规法和培养基稀释法进行该药品的微生物方法学验证。结果采用常规法时，白色念珠菌、黑曲霉的菌回收率均高于70 %，采用培养基稀释法（0.2 ml/皿）时，金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌的菌回收率均高于70 %；细菌计数可用培养基稀释法（0.2 ml/皿），霉菌和酵母菌计数可用常规法，控制菌铜绿假单胞菌可用常规法检查，金黄色葡萄球菌可用200 ml培养基稀释法检查。结论该法能有效地消除药品中抑菌物质的干扰，检出率高。

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