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康腹止泻片微生物限度检查法验证


录入时间:2011-9-23 11:59:42 来源:中国论文下载中心

 

【摘要】  目的 建立康腹止泻片微生物限度检查法。方法 采用培养基稀释法。结果 该法能有效消除康腹止泻片在检验条件下对细菌、真菌及酵母菌的抑制作用;控制菌可用常规法检查。结论 该法简单、快捷,可用于康腹止泻片的微生物限度检查,有效控制其质量。  

【关键词】  康腹止泻片;微生物限度检查;培养基稀释法

  康腹止泻片是由木馏油、老鹳草粉、黄柏干浸膏等药材经加工而成的中成药片剂。本品味特异,具有化滞止泻功效。用于饮食不节或水土不服导致的食欲不振、恶心呕吐、腹胀腹泻、消化不良等症。处方中的老鹳草、黄柏具有一定的抑菌作用[12],若用常规法对其进行微生物限度检查,结果将不能真实反映样品的污染情况[3]。为此,根据《中国药典》2010年版的有关规定[4],对康腹止泻片微生物限度检查方法进行验证,以确定其是否适用于本品的微生物限度检查,从而准确有效地检出样品中污染的微生物[5]。验证表明,采用培养基稀释法对本品进行检查,可使污染的微生物能被顺利检出,常规法则可用于控制菌的检查。该方法简便、快捷、准确、可行,能有效控制康腹止泻片的质量,并可为同类药品的微生物限度检查法提供科学的实验依据。 

  1 仪器与试药 

  1.1 菌种 

  金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)10123],均购自中国药品生物制品检定所;黑曲霉(ATCC16404)购自广东省微生物研究所。 

  1.2 培养基 

  营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、胆盐乳糖培养基。 

  1.3 供试品 

  康腹止泻片(批号41EA1),大幸药品株式会社。 

  2 方法与结果 

  2.1 菌液的制备[4] 

  2.1.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌 

  取新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中,培养1824 h;培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50100 cfu的菌悬液。用于控制菌验证时制成每1 mL含菌数为<100 cfu的菌悬液。 

  2.1.2 白色念珠菌 取新鲜培养物接种至改良马丁培养基中,培养2448 h;培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50l00 cfu的菌悬液。 

  2.1.3 黑曲霉 取新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中,培养57 d,加入0.9%无菌氯化钠溶液35 mL,将孢子洗脱。然后,用适宜的方法吸出胞子悬液至无菌试管内,用0.05%(体积分数)聚山梨醇的0.9%(体积分数)无菌氯化钠溶液制成每l mL含孢子数50100 cfu的孢子悬液。

2.2 供试液的制备 

  取样品10 g,加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL,用匀浆仪打碎,摇匀,制成110的供试液。 

  2.3 验证试验 

  验证实验所用培养基均按《中国药典》2010年版附录“微生物限度检查法”要求,进行培养基适用性检查,且均符合规定。 

  2.3.1 细菌、真菌及酵母菌计数(平皿法培养基稀释法) 在确定适合的检查方法后,验证试验至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 

  试验组:各取110供试液10.50.2 mL和试验菌液1 mL,分别注入平皿中,立即倾注相应琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌数。 

  菌液组:取试验菌液1 mL注入平皿中,立即倾注相应琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,测定所加的试验菌数。 

  供试品对照组:各取110供试液10.50.2 mL,按试验组操作,不加菌液,测定样品本底菌。 

  计算各试验菌株的回收率,结果见表1。表1 计数验证菌各菌株回收率结果 

  由表1可见:黑曲霉的回收试验,当供试液为1 mL·皿-1时,3次试验的回收率均即可达到70%以上;白色念珠菌当稀释至0.5 mL·皿-1时,3次试验的回收率达到70%以上;而大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌3个菌株的回收率试验,要稀释至0.2 mL·皿-13次验证的回收率才能均达到70%以上。因此本品的细菌计数、真菌及酵母菌计数均可用培养基稀释法检查:细菌计数用0.2 mL·皿-1,真菌及酵母菌计数用0.5 mL·皿-1 

  2.3.2 控制菌检查法的验证 本品为含有药材粉末投料的口服制剂,控制菌应检查大肠埃希菌和大肠菌群,验证大肠菌群检查法时,采用大肠埃希菌作为试验菌。 

  2.3.2.1 大肠埃希菌检查法的验证 取110供试液10 mL及大肠埃希菌菌液1 mL加入100200 mLBL增菌培养基中,按大肠埃希菌的检查法进行检验。 

  2.3.2.2 大肠菌群检查法的验证 取110供试液1 mL及大肠埃希菌菌液1 mL加入不少于1530 mL的胆盐乳糖发酵培养基中,按大肠菌群的检查法进行检验。 

  由表2可知,试验组均检出大肠埃希菌,因此本制剂的大肠埃希菌和大肠菌群均可用常规法检查。 

  4 讨论 

  本品含有木馏油、阿仙粉、黄柏粉等成分,有一定的抑菌作用,验证试验结果证明,本品对革兰阳性菌有较强的抑制作用。药典收载的除去供试品抑菌作用的方法有培养基稀释法、薄膜过滤法、离心沉淀法等,或几法联用。由于本品是中成药,推断其抑菌作用不会太强,因此尝试采用培养基稀释法,通过扩大培养基的使用量,使供试品在培养基中稀释,结果各规定菌株的回收率均达到药典要求;控制菌则用常规法即能顺利检出试验菌。培养基稀释法操作简单,不需要特殊仪器设备,只需增加培养基量,即可很好地消除本制剂在试验条件下的抑菌作用问题,因此本方法简便快捷、准确有效,能很好地控制康腹止泻片的质量。表2 控制菌验证结果

  作者:朱文娟,林铁豪,钟燕飞,林丽英  

【参考文献】

   [1] 金晴昊,崔京浩,郭健鹏.老鹳草的研究[J].时珍国医国药,200516(9)840-841.

  [2] 金建玲,栾永娜,华国强.含小檗碱中药的抑菌活性与小檗碱含量的关系[J].中医药学报,200533(5):19-21.

  [3] 许华玉,杜鹃,汤杨.药品中微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准,2005,6(4):262,46-47.

  [4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2010:附录79.

[5] 林丽英,湛文青,饶春意.野牡丹止痢片微生物限度检查法的建立[J].中药材,2006,29(3):299-302.

 

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