用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞

下面的简单方案是Clhen等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒ＤＮＡ产生5x106-2x107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且比方案Ｉ快速，重复性更好。该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。

1、从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径２－３mm），转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约３小时（旋转摇床，300转/分）。为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞ml，可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各黧度的增减物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。

2、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。切记：下述所有步骤均需无菌操作。

3、于４℃用Sorvall GS3转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。

4、倒出培养液，将管倒置１分钏以使最后残留的痕量培养液流尽。

5、以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。我们发现将１mol/L CaCl2贮存液[用纯水（Ｍille-Q级或与其相当的级别）配制]以10ml小份贮存于-20℃煞是方便。制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100mlk，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。对于大多数大肠肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在这一步采用TFB（见表1.3）代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。

6、于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。

7、倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。

8、每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2[或ＴＦＢ，见表1.3和步骤５）注]重悬每份细胞沉淀。此时，可将细胞分成小份，放于-70℃冻存[有关讨论请参见53页本节（二）步骤11)b.c)]。在这些条件下，尽管长期保存后转化效率会稍有下降，但细胞仍可保持处于感受态。Dagert和Ehrlich(1979)曾表明细胞可以于４℃在CaCl2溶液中保存24-48小时，在贮存的最初12-24小时内，转化效率增加３－５倍，然后降低到初始水平。

9、用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加ＤＮＡ（体积∞10μl,ＤＮＡ∞50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。

10、将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管回上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。

11、快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却１－２分钟。

12、每管加800μlＳＯＣ培养基（见附录Ａ）。用水溶将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。如果要求更高的转化效率，在复苏期中，应温和地摇动细胞（转速不超过225转/分）。

13、将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和相应抗生素的ＳＯＢ琼脂培养基上。如培养物体积太小（〈10μl）。可再加肉汤培养基，用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平板表面。如在一个90mm平板上铺200μl以上的感受态细胞，应离心浓缩细胞，然后用适量ＳＯＣ轻轻重悬细胞。如用四环素抗性作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上（或铺在软琼脂中）。然而如选用氨苄青霉素抗性，则只能将一部分培养物（根据实验决定）铺在单独的平皿上。氨苄青霉素抗性功的增加与平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞可释放生长掏物质的缘故。

14、将平板置于室温直至液体被吸收。

15、倒置平皿，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落。如检查氨苄青霉素抗性，用转化细胞铺增板时密度较低（每个90mm平板不超过104菌落），于37℃培养平板时不应超过20小时。氨苄青霉素抗性的转化可将β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。这样，铺平板时密度太高或培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而改用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从60μg/ml增至100μg/ml，可使情况有所改善，但不能彻底根除之。

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