真菌染色新方法的探索

　　［关键词］ 真菌菌种；盖玻片；棉兰染色液

　　真菌的种类很多，在自然界分布极广，它的形态结构复杂，菌丝体和孢子的形态特征随真菌种类不同而异，是鉴别真菌的重要依据。传统的真菌染色方法，常常造成真菌孢子脱落，从而改变了它原有的形态构造，影响观察、鉴定［1］。我们经多次反复摸索，利用真菌菌丝体呈上耸向空间生长特征，用插片法使菌丝体生长在盖玻片上，这样制作的真菌染色片效果更为理想，在以往的文献中还未见报道。现将本方法报道如下。

　　1  材料与方法

　　1．1  菌种 

　　青霉菌、黑曲菌、黄曲菌、毛霉菌、石膏样小孢子菌、絮状表皮癣菌等，以上菌种均为本实验室保存提供。

　　1．2  染液的配制染液 

　　苯酚(结晶品)20 g，乳酸20 ml，甘油40 ml，棉兰(Cotton blue)0．05 g，蒸馏水20 ml，将苯酚、乳酸、甘油溶解于蒸馏水中(可微加热)，再加入棉兰，摇匀，备用。

　　1．3  沙氏培养基的制备

　　蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂1 g，蒸馏水1 000 ml，68.95 kPa，20 min，备用［2］。

　　1．4  方法

　　1．4．1  设试验组与对照组两组，各染片100张。试验组即改良的真菌染色法［4］，将沙氏培养基倾注大平板，取无菌盖玻片沾上融化的沙氏培养基，密集竖立插在大平板上，将上述菌种用灭菌蒸馏水轻轻刮下，滴在大平板上，并轻轻摇动，使之均匀分布于平板表面，盖上平板盖，于25 ℃～28 ℃湿盒孵育，72 h取出后，用镊子轻轻取出盖玻片，用火焰固定或自然晾干后，滴上棉兰染色液，2 h~3 h后，于水中轻柔漂洗，然后晾干，放载玻片上封片。对照组即传统的真菌染色法，在无菌载玻片上滴加融化的沙氏培养基1滴~2滴，将菌种接种在沙氏培养基上，加盖无菌盖玻片，于25 ℃～28 ℃湿盒孵育，72 h取出后，揭开盖玻片，滴加染液，使真菌培养物与棉兰染液混合染色［3］。

    4．2  染色效果评判标准 

　　优片：镜下观察可见真菌菌丝体和孢子形态保持自然完整，孢子基本没有脱落，底影干净、清晰；良片：在镜下观察可见大部分菌丝与孢子形态较为完整、有少许脱落、底影较脏；差片：在镜下观察可见孢子与菌丝分离、脱落、底影脏，形态不完整。

　　2  结果

　　试验组：染片100张属优片有80张，良片有10张，差片有10张；对照组：染片100张属优片有10张，良片有10张，差片有80张。两组优片率比较差异有统计学意义(P<0.01)。

　　3  讨论

　　两种不同染色方法的结果比较，可以看出制片效果有以下明显差异：传统法由于菌种接种在载玻片琼脂培养，棉兰液染色时，染料挂有琼脂，镜下可见底影脏，影响检测效果；改良法是直接滴加棉兰染液在盖玻片上进行染色，这样有效减少杂质的干扰，提高底影洁净度，镜下可见干净、清晰；传统法掀开盖玻片，容易使孢子与菌丝分离、脱落；改良法是利用真菌菌丝体和孢子向上生长构造，菌丝体和孢子生长在盖玻片上，使真菌形态保持自然完整。我们经多次反复实践证明，本法简单、易掌握，效果好并适合大批量快速制片，不失为一种真菌染色的新方法。

　　参考文献：

　　［1］张子康，何光泽，等．医学微生物学与免疫学实验教程［M］.第1版．四川：四川科学技术出版社，1989：7．

　　［2］陆德源.医学微生物学［M］.第5版.北京：人民卫生出版社，2002，11(5).

　　［3］凌启波，梁英杰．常见真菌的形态学特征和常用染色方法［J］．临床与实验病理学杂志，2003，10：19．

　　［4］陈倪勇，肖永波．介绍一种真菌的方法［J］.中华病理学杂志，2001，10．

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