作者：崔堂兵，刘煜平，郭勇，刘治猛
摘要：对枯草芽孢杆菌BS-06产生抗真菌素的条件进行优化，确定最佳发酵条件为：培养时间为48h，装液量为50mL，初始pH值为8.0，培养基中添加2%麦芽糖、0.2%硝酸钾和1%吐温-80。指出枯草芽孢杆菌BS-06产生的抗真菌素具有较广的抗菌谱，对水稻纹枯病菌、稻瘟病菌、节瓜和冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌均有较好的抗菌效果，有望开发成生物农药来防治农作物病原真菌。
关键词：枯草芽孢杆菌；农用抗生素；抗真菌素；病原真菌
病原真菌会引发多种疾病，特别是植物病原真菌引起的植物病害已经位居植物三大类病害（真菌病害、细菌病害和病毒病害）之首，如在水稻上发生的240多种病害中，真菌病害占90%。真菌引起植物的多种病害，不仅影响农作物的产量及经济动物的生长，而且还造成极大的经济损失。
长期以来，在防治植物真菌病害中，人们大量使用化学农药，导致了三大难题：（1）环境污染，残毒积累，最终危害人类的健康；（2）病原真菌抗药性直线上升；（3）杀死有益微生物，破坏了植物体内微生物种群的平衡，致使病原真菌成为优势种群，加剧病害的暴发流行。微生物来源的抗真菌抗生素作为生物农药的一个重要分支，具有高效、易分解、无残留、不污染环境等优点，因而日益受到人们的重视。目前已经被广泛应用于防治植物真菌病害的有井冈霉素、春雷霉素、多抗霉素、农抗120、中生菌素、武夷菌素、新多氧霉素、庆丰霉素等。我们从土壤中分离得到1株产抗真
菌物质（抗真菌素）的菌株，经鉴定属枯草芽孢杆菌，命名为BS-06。该菌产生的抗真菌素对农业上多种致病真菌具有良好的抗性，可望开发成为环保型的生物农药。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株 枯草芽孢杆菌BS-06 菌株由华南理工大学生物科学与工程学院生化实验室分离、鉴定和保存，水稻纹枯病菌、稻瘟病菌、水稻纹枯病菌为广东省农科院水稻研究所保存，节瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌和苦瓜枯萎病菌为广东省农科院蔬菜研究所保存。
1.1.2 培养基
PDA培养基平板：新鲜马铃薯去皮后，取200g切成小块，加1000mL蒸馏水，煮沸30min后用纱布过滤，得马铃薯浸汁；然后加入葡萄糖和琼脂粉各20g，充分溶解后，于121℃下灭菌后倒平板，每个直径9cm的培养皿中倒20mL，冷却后备用。
种子培养基：取牛肉膏0.8g、酵母粉0.5g、葡萄糖1g，溶于 100mL 蒸馏水中，于121℃ 下灭菌后备用。
发酵培养基：生长曲线和抗真菌素积累曲线实验 取1000mL蒸馏水中加入牛肉膏8g、酵母粉5g、葡萄糖5g、NaH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.2g、CaCl2·2H20 0.2g，分装于250mL三角瓶中，装液量为50mL，自然 pH 值，于121℃下灭菌后备用。其他实验的无机盐成分相同，并根据不同实验目的添加不同种类和不同浓度的碳源、氮源、吐温-80，除不同 pH 值实验外均采用自然pH，除不同装液量实验外装液量均为50mL。
1.2 试验方法
1.2.1 生长曲线和抗真菌素积累曲线的测定 取斜面菌种 1 环，接种于种子培养基中，在摇床上于 150r/min、30℃.条件下培养12h，作为种子液。按5%的接种量分别接种到上述液体发酵培养基中，在摇床上于150r/min、30℃.下培养，每12h 取出3瓶，用分光光度计测定发酵液 600nm 的 OD 值。将各发酵液分别置于6000r/min 下离心 15min，取上清液，进行抗真菌效果实验。
1.2.2 发酵条件优化试验# 取斜面菌种1 环，接种于种子培养基中，在摇床上于150r/min、30℃ 条件下培养12h，作为种子液。将种子分别接种到液体发酵培养基（无机盐成分与生长曲线实验相同，其他实验根据实验目的不同添加其他成分）中，在摇床上于150r/min、30℃.下培养48h。取发酵液于6000r/min 下离心15min，取上清液，进行抗真菌效果实验。
1.2.3 抗真菌效果实验 除了抗菌谱实验外，其他实验均采用水稻纹枯病病菌。取水稻纹枯病等致病菌1 环，接入5mL 无菌水中，振荡均匀，制成菌悬液。吸取0.1mL 致病菌菌悬液，均匀涂布于 PDA 培养基平板上，然后在平板上打直径0.5cm 的孔，每个平板打6个孔，于孔内加入离心后的发酵液上清 30uL，置于25℃.培养箱中培养4天，测量抑菌圈直径（mm），以抑菌圈直径大小表示抗菌效果。
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