新型阪崎肠杆菌选择性分离培养的研制(1)

摘 要：目的：筛选一种新型、特异性高的阪崎肠杆菌选择性培养基。方法：通过药敏实验，筛选出对阪崎肠杆菌耐药而对其他杂菌敏感的抗生素；利用抑菌浓度实验、抗生素组合平板实验，筛选出最佳的抗生素组合方式及浓度。将抗生素组合与显色剂添加到基础培养基中，配制成阪崎肠杆菌的新型选择培养基。结果：组合抗生素(4ug/mL万古霉素、0.1ug／mL头孢噻吩)和显色剂(0.1g／L 5-溴-4氯-3-吲哚-a-葡萄糖苷)添加到脑心培养基中，制成阪崎肠杆菌Vc 选择性显色培养基，能最大限度地抑制杂菌生长，而对阪崎肠杆菌的生长没有影响。经灵敏性实验，对接种的奶粉样品中的阪崎肠杆菌的检出限达到1 cfu。结论：制得的新型阪崎肠杆菌选择性培养基特异性强、灵敏度高，可用于奶粉样品的分离检测。

关键词：阪崎肠杆菌，检测，培养基

阪崎肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，有周生鞭毛，能运动。婴幼儿常因食用了污染阪崎肠杆菌的奶粉而引起感染，临床表现为脑膜炎、败血症、坏死性结肠炎等症状，死亡率较高，因此受到食品主管部门和奶粉生产企业的高度重视。目前，分离阪崎肠杆菌常用培养基为结晶紫中性红葡萄糖胆盐琼脂(VRBGA)和显色培养基。但由于其选择性较差，实际使用时分离效果不理想，给检测工作带来极大的困难。本实验拟通过大量的阪崎肠杆菌和非阪崎肠杆菌药敏实验，寻找合适的抑菌剂，添加到基础培养基中，并结合显色剂，研制出新的阪崎肠杆菌选择性分离培养基，可大大地提高培养基的选择性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

阪崎肠杆菌标准株(45001) 购自中国药品生物制品检定所；23株野生株阪崎肠杆菌由本实验室在检测样品中分离；非阪崎肠杆菌(大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌共1O株)购自中国药品生物制品检定所或由本实验室保存；脑心琼脂购自北京陆桥生物技术有限公司；药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；抗生素购自Amresco公司；API20E生化试剂条购自生物梅里埃公司。

1.2 实验方法

l.2.1 药敏实验对实验菌株进行82种抗生素的药敏实验，方法参照WS／T 125—1999《纸片法抗菌药物敏感实验标准》。

l.2.2 抗生素定量抑菌浓度实验从营养琼脂上取新鲜菌落，用2倍浓缩肉汤调节细菌浓度到l麦氏单位；在细胞培养板上用无菌水将适当浓度的抗生素由初始浓度依次稀释至2^-1、2^-2、2^-3、2^-4、2^-5。各稀释梯度分别加入与抗生素等体积的2倍浓缩肉汤菌液，相当于将抗生素再次稀释了一倍，菌液浓度相当于0.5麦氏单位；同时设置空白对照(2倍浓缩肉汤+无菌水)和细菌生长对照(2倍浓缩肉汤菌液+无菌水)；37℃培养l8h，用酶标仪在63Onm 处测定菌液0D值。

1.2.3 抗生素平板抑菌实验将所筛选出的抗生素以不同的浓度以及不同组合添加到脑心培养基中，制备成抗生素平板，涂布阪崎肠杆菌和非阪崎肠杆菌，观察其选择性。

1.2.4 阪崎肠杆菌选择性显色培养基(Vc选择性显色培养基)对不同细菌的生长效果实验将所筛选出的抗生素组合(万古霉素4ug／mL、头孢噻吩0.lug／mL)添加到脑心琼脂平板中，同时添加显色剂(5-溴-4氯-3-吲哚-a-葡萄糖苷，0.1g/ L)，制备成阪崎肠杆菌Vc选择性显色培养基。为评价其对不同细菌生长的作用，取 问菌量阪崎肠杆菌芮液及高含量的其他实验菌株菌液，滴加到抗生素平板上，37℃ 培养24h，观察细菌生长情况。

1.2.5 Vc选择性显色培养基检测实际样品的检出限实验    取新鲜阪崎肠杆菌菌液，依次10倍稀释至10^-11，每个稀释度同时做菌落计数。取1Og奶粉样品(已确认无阪崎肠杆菌)，加入到90mL无菌水中，添加1 mL稀释后的菌液(稀释度从10^-4～10^-11各一份)，37℃ 培养18h；取lOmL培养液，加入到9Oml EE增菌肉汤中，37℃ 培养18h；接种到Vc 显色平板及VRBGA平板各1份，37℃培养18h，取可疑菌落进行API20E 生化鉴定。

2 结果与分析

2．1 药敏实验结果

本实验旨在筛选出对阪崎肠杆菌耐药而对其他非阪崎肠杆菌敏感的抗生素，以添加到基础培养基中，来抑制杂菌生长。利用本实验室从奶粉中分离得到的23株野生型阪崎肠杆菌菌株，通过牛化实验分成7个生化。生化型的不同反映了菌株之间基因上的差异，而菌株的耐药性也与基因有关。因此，本实验在7种生化型中各取l株作为代表株，进行下一步的药敏实验。

用7种生化型的阪崎肠杆菌对82种抗生索进行药敏纸片实验。结果表明，青霉素G、苯唑青霉素、红霉素、克拉霉素、罗红霉素、新生霉素、乙酰螺旋霉索、柱晶白霉索、林可霉素、万古霉素、麦迪霉素、氟洁霉素、两性霉素、制霉菌素、灭滴灵、替考拉宁、氟康唑、依康唑、多粘菌素B、头孢噻吩等20种抗生素对阪崎肠杆菌不敏感。

选取10株非阪崎肠杆菌进行上述20种抗生素的药敏实验，这10株非阪崎肠杆菌具有广泛的代表性，用之所筛选出的抗生素能对绝大多数杂菌有抑制效果。结果表明，青霉素G、红霉素、万古霉素、多粘菌素B、利福平、头孢噻吩6种抗生素对阪崎肠杆菌耐药，而对部分非阪崎肠杆菌敏感。

2.2 定量抑菌浓度实验结果

为了寻找出抑菌剂准确的作用剂量，以应用于选择性培养基中，选取对阪崎肠杆菌耐药而对非阪崎肠杆菌敏感的6种抗生素进行抑菌浓度实验。

结果显示，万古霉索浓度在4ug／mL时，对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌有明显的抑菌效果，而对阪崎肠杆茼尤抑制表现，表明可以用于Vc、选择性显色培养基。头孢噻吩对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌都有明显抑菌效果，但在高浓度(16ug／mL以上)时，对阪崎肠杆菌也有抑菌效果，提示可选用其低浓度(1ug／mL及以下)用于Vc选择性显色培养基。红霉素在lug／mL时，显示对所有非阪崎都有一定的抑菌效果，但抑菌效力不高，提示可加大浓度用于Vc选择性显色培养基。利福平、多粘菌素B、青霉素G则即使在高浓度时也对非阪崎肠杆菌的抑菌效力不明显。因此选择万古霉素、头孢噻吩、红霉素3种抗生素，以检测其在培养基中不同的浓度对阪崎肠杆菌与非阪崎肠杆菌的实际生长抑制情况。

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