新型阪崎肠杆菌选择性分离培养的研制(2)

2.3 抗生素的平板抑菌实验结果

将万古霉素、头孢噻吩、红霉素分别以不同的浓度添加到基础培养基(脑心琼脂)中，接种定量菌液，观察抑菌效果，以确定最终的抗生素组合和添加浓度。结果表明，万古霉素、头孢噻吩适合使用于阪崎肠杆菌选择性培养，与定量抑菌实验结果一致；而红霉素与定量抑菌浓度实验结果不一致，不适合使用于阪崎肠杆菌选择性培养。

将万古霉素(4ug／mL)和头孢噻吩(0.1ug／mL)两种抗生素组合添加到基础培养基中，制备成抗生素选择培养基，阪崎肠杆菌能生长， 10株非阪崎肠杆菌中的9株(大肠杆菌、沙氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌)均被抑制，没有生长，只有产气肠杆菌能生长。表明在基础培养基中添加两种抗生素明显起到了抑制大部分杂菌的效果，结果见图1。从网中可看出，万古霉素和头孢噻吩两者的抗菌谱有交叉、也能互相补充，两者结合使用于阪崎肠杆菌选择性培养基中，具有除阪崎肠杆菌外比单一抗生素更广泛的抑菌谱。

2．4 Vc选择性显色培养基对不同细菌的生长效果

尽管在基础培养基中添加了抗生素组合后，抑制了绝大部分杂菌，但不可避免地仍有少量杂菌生长。为进一步增强培养基的特异性，在培养基中添加了显色剂(5-溴-4氯-3-吲哚-a-葡萄糖苷，0.1ug／L)，阪崎肠杆菌能分解显色剂，呈蓝绿色，从而与其他杂菌区分开。

为验证V 选择性显色培养基(基础培养基+抗生素组合+显色剂)是否适合阪崎肠杆菌的生长，取不同阪崎肠杆菌浓度的10u L菌液(菌量分别为1000、1O0、10、1cfu／mL)涂布到平板培养24h，四个接种部位都有菌生长，菌落呈蓝绿色，说明该培养基完全不会抑制阪崎肠杆菌的生长，结果见图2。同时，取10uL 非阪崎肠杆菌菌液(菌量约10000cfu／mL)涂布到平板培养24h，除产气肠杆菌有生长外，其他9株非阪崎肠杆菌均未生长。产气肠杆菌虽有生长，但菌落呈土黄色，与阪崎肠杆菌菌落容易区分。

2.5 Vc选择性显色培养基检测实际样品的检出限

为测定Vc选择性显色培养基对实际样品的检出限，人工定量污染阪崎肠杆菌到奶粉样品，用Vc选择性显色培养基和SN／T 1632．1—2005 中的VRBGA平板进行对照检测。检测结果表明，VRBGA平板上有杂菌生长，而Vc选择性显色培养基成功抑制了杂菌，增强了特异性。Vc选择性显色培养基检出限达到1cfu，显示了良好的灵敏性。

3 讨论

最早用于分离阪崎肠杆菌的培养基是美国FDA推荐的VRBGA，该菌在VRBGA 平板上可长成两种菌落，一种是典型的光滑型菌落，容易被接种环移动；另一种是干燥型或黏液状菌落，但大部分生长成黏液状、周边有胆汁酸沉淀的红色菌落。但部分其他肠杆菌科细菌在VRBGA上也能形成红色菌落，不容易区分。

阪崎肠杆菌都有α-D-葡萄糖苷酶活性，利用这一特点，在基础培养基中加入5-溴-4氯-3-吲哚-a-葡萄糖苷，可制成显色选择培养基 。阪崎肠杆菌在显色培养基上呈蓝绿色菌落，但其他一些细菌在显色培养基上也能产生颜色，如金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、无害李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌呈蓝色或蓝紫色，肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种菌落中心呈蓝绿色，泛菌属的菌落与阪崎肠杆菌几乎不能区分。另据报道，伤口埃希氏菌、克氏柠檬酸杆菌在显色培养基上产生蓝绿色菌落，非脱羧勒克氏菌菌落中心呈蓝色，可见单靠显色剂并不能达到区分阪崎肠杆菌和杂菌的目的。

设计选择性培养基的另一种常用方法是在基础培养基中添加合适的抑菌剂抑制杂菌生长，从而有利于目标菌的分离培养。在设计阪崎肠杆菌培养基时，Iversen 添加了脱氧胆酸钠；Oh添加了3号胆盐；赵贵明 添加了月桂基硫酸钠。但这些抑菌剂主要是抑制革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌效果不大，且不具有特别针对性，所以制备成的培养基抑制杂菌效果并不理想。本研究结合药敏实验及抑菌实验，找到合适的抗生素组合(万古霉素+头孢噻吩)及浓度，既能抑制大部分杂菌，又不影响阪崎肠杆菌生长。万古霉素主要是抑制革兰氏阳性菌，头孢噻

吩是广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有一定效果，但阪崎肠杆菌对其耐药。因此选择这两种抗生素进行组合，起到了很好的抑制杂菌作用。但仍然有少数杂菌(如产气肠杆菌)无法抑制，因此在培养基中添加显色剂，进一步增强选择性。

此外，用VRBGA 平板来分离阪崎肠杆菌，该培养基含有酵母粉、蛋白胨、葡萄糖等成分，营养非常丰富，阪崎肠杆菌在该培养基上疯狂生长成片状，常掩盖了杂菌的存在，不利于叮疑菌落的分离，易导致下一步鉴定的失败。而本研究建立的Vc选择性显色培养基，营养适中，且包含适当浓度的抗生素，能抑制阪崎肠杆菌的过度生长，但不影响其检出水平，菌落大小适度，菌落形态规则，菌落之问有明显间隙，便于挑选，见图3。结合抗生素和显色剂，制备成阪崎肠杆菌选择性培养基。经模拟样品检测，表明该培养基能检测到1cfu，具有良好的检测限。本研究建立的培养基可应用于奶粉及相关产品中阪崎肠杆菌的检验。

作者：杨万颖，祝仁发，李传礼，赖心田，杨国武

作者单位：深圳市计量质量检测研究院，广东深圳518131

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