关键词：显色培养基；沙门氏菌；快速检测
沙门氏菌是肠杆菌科中一重要致病菌属，也是引起细菌性食物中毒的主要病原菌之一。随着食品生产和国际贸易的迅速发展，沙门菌检测作为食品安全与质量检测的重要指标，目前国内采用的国标法(GB4789．4—2003)只适用于沙门菌的选择性分离培养，不能特异性检出沙门菌。用显色培养基检测细菌是一种新的快速方法，通过在培养基中加入细菌特异性酶的显色底物，直接观察菌落颜色就可对菌种作出鉴定。本文通过对培养基的灵敏度、特异性以及实际样品检测，比较了CHROMagar沙门菌显色培养基简称(CHROMagar)、HK沙门菌显色培养基(简称HK)与传统平板DHL的检测效果。
1 材料与方法
1.1 标准菌株来源 大肠杆菌ATCC25922、费氏柠檬酸杆菌ATCC8090、鼠伤寒沙门菌CMCC(B)50115、金黄色葡萄球菌ATCC6538、肠炎沙门菌CMCC(B)50335、汤卜逊沙门菌CMCC (B)50023、伤寒沙门菌CMCC (B)50071、奇异变形杆菌CMCC(B) 49005、嗜水气单胞菌GIM1.172、铜绿假单胞菌ATCC9027，均由广东省微生物研究所提供。
1.2 培养基及试剂CHROMagar沙门菌显色培养基由法国科玛嘉公司提供；HK沙门菌显色培养基基础和选择性添加剂由广东环凯微生物科技有限公司提供；DHL干粉培养基由北京陆桥技术有限责任公司提供；GNI +试剂条由法国梅里埃公司提供。
1.3 主要仪器法国生物梅里埃公司Biomerieux全自动微生物鉴定系统(VITEK32)。
1.4 样品从广东省污染物监测网检测结果中挑取微生物污染严重的样品，其中熟食20份，蔬菜、牛奶各10份。
1.5 方法
CHROMagar沙门菌显色培养基、HKM沙门菌显色培养基、DHL干粉培养基均按说明书制备。
将大肠杆菌、费氏柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌、汤卜逊沙门菌、伤寒沙门菌、奇异变形杆菌、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌沙门菌参考菌株画线接种在营养琼脂培养基上37℃培养24h后，挑取单菌落加到10ml 0.85％生理盐水中配成原液(n ×108scfu／m1)，然后进行10倍梯度稀释，取10-5 、10-6 、10-7 菌液各100ul，分别涂布CHROMagar培养基、HK培养基平板，37℃培养24h，观察菌落特征、量取菌落直径和计算沙门菌平板的菌落数。
1.6 分离鉴定 将疑似菌落分离纯化，用法国梅里埃公司GNI+ 试剂条进行生化鉴定。
2 结果
2.1 显色培养基的特异性 CHROMagar培养基、HK培养基均有较好的显色效果。CHROMagar培养基上的沙门菌菌落为紫色，HK培养基上沙门菌菌落呈现品红色(见表1)；金黄色葡萄球菌在两种培养基上均不生长；嗜水气单胞菌和铜绿假单胞菌在HK培养基上不生长，在CHROMagar培养基上生长且颜色与沙门菌相似(分别为紫色和浅紫红色)；变形杆菌在CHROMagar培养基上不生长而在HKM培养基上的菌落为白色，可与沙门菌相区分；费氏柠檬酸杆菌和大肠杆菌在两种培养基上均为蓝绿色。
表1 不同沙门菌种的菌株在显色培养基上的生长情况
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测试菌株名称 |
CHROMagar沙门氏菌显色培养基 |
HKM沙门氏菌显色培养基 | ||||
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菌落颜色 |
菌落直径（mm） |
菌落数（cfu/皿） |
菌落颜色 |
菌落直径（mm） |
菌落数（cfu/皿） | |
|
鼠伤寒沙门菌 |
蓝紫色 |
1.7 |
6.4*108 |
品红 |
2.15 |
7.9*108 |
|
肠炎沙门菌 |
浅紫色 |
1.77 |
7.4*108 |
品红 |
2.93 |
1.1*109 |
|
汤卜逊沙门菌 |
蓝紫色 |
1.56 |
1.1*109 |
品红 |
3.07 |
1.4*109 |
|
伤寒沙门菌 |
浅紫红色 |
1.97 |
7.3*108 |
品红 |
0.95 |
6.8*108 |
2.2 显色培养基的灵敏度 由表1可见，涂布相同浓度和剂量的4种沙门菌在两种显色培养基平板上，37℃培养24h后，菌落总数和菌落直径结果均有差异。肠炎沙门菌在HK平板上的菌落数比在CHROMagar平板上约多5倍，汤卜逊沙门菌和伤寒沙门菌的结果较相近。伤寒沙门菌在CHROMagar 培养基上菌落直径(1.97mm)远大于HK培养基(0.95mm)，其他3种沙门菌在HK培养基上的菌落大于CHROMagar培养基上的。
2.3 实际样品检测 40份实际样品检测出的阳性菌株经VITEK32的GNI+ 鉴定，结果详见表2。
表2 三种培养基检测40份样品中沙门菌结果比较
|
样品名称 |
份数 |
DHL培养基 检出数（%） |
CHROMagar检出数（%） |
HK培养基检出数（%） |
|
熟食 |
20 |
16（80.0） |
13（65.0） |
17（85.0） |
|
牛奶 |
10 |
9（90.0） |
9（90.0） |
9（90.0） |
|
生鸡肉 |
10 |
9（90.0） |
9（90.0） |
9（90.0） |
|
总计 |
40 |
34（85.0） |
31（77.5） |
35（87.5） |
3 讨论
沙门菌广泛存在于自然界中，主要是通过食品(特别是动物性食品)传播、感染人体。国标法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点，已远远不能满足现代检测要求。显色培养基法的原理是使用适当的荧光或显色底物，在细菌特异性酶作用下，产生荧光或显示一定颜色，用紫外灯观察细菌产生的荧光或直接观察菌落颜色，减少对菌株进行纯培养和生化鉴定步骤，可以把检测、计数和鉴定一次完成，缩短检测周期。
HKM和CHROMagar 培养基上的沙门菌呈现品红或紫色的菌落与各自特异的酶底物和显色剂有关。两种培养基均能抑制金黄色葡萄球菌的生长，大肠杆菌、费氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌等杂菌或被抑制或菌落颜色与沙门菌有明显差别。在CHROMagar培养基上，嗜水气单胞菌和铜绿假单胞菌与沙门菌菌落颜色无法区别，而HK显色培养基对这两种菌有良好的抑制作用。从4种沙门菌的涂布培养结果可见，伤寒沙门菌在CHROMagar培养基上的菌落较大，而HK培养基对某些沙门菌检测的灵敏度比CHROMagar培养基多数倍，菌落直径也明显较大。
在实际样品检测中，3种培养基对牛奶、生鸡肉中沙门菌的检出率相同，而对熟食样品检出率差异较大，原因可能是熟食在生产加工的过程中添加的有机和无机成分种类多且复杂，影响了酶与底物的反应，同时熟食较牛奶和生鸡肉杂菌污染量大，使检测结果出现一定比例假阳性或假阴性，从而干扰目标菌的检测，降低显色培养基的敏感性和特异性。
综上所述，显色培养基在微生物检测中的应用，可大大提高测效率，满足应急需要。
作者：朱海明 ，赖蔚苳，卢勉飞，杨冰 ，王海燕 ，柯昌文 ，严纪文 ，王建
参考文献：
[1]余泼．医学微生物学[M]．北京：人民卫生出版社，1983，303 305．
[2]吴清平，周艳红，蔡芷荷．卫生微生物特异性显色培养基的研究与应用[J]．中国卫生检验杂志，2005，15(1)：124—126．
[3]卢勉飞，吴清平，刘云林，等．特异性酶反应在食源性致病菌检测中的应用[J]．中国卫生检验杂志，2005，15(3)：354～356
1.4*109
伤寒沙门菌
浅紫红色
1.97
7.3*108
品红
0.95
6.8*108
2.2 显色培养基的灵敏度 由表1可见，涂布相同浓度和剂量的4种沙门菌在两种显色培养基平板上，37℃培养24h后，菌落总数和菌落直径结果均有差异。肠炎沙门菌在HK平板上的菌落数比在CHROMagar平板上约多5倍，汤卜逊沙门菌和伤寒沙门菌的结果较相近。伤寒沙门菌在CHROMagar 培养基上菌落直径(1.97mm)远大于HK培养基(0.95mm)，其他3种沙门菌在HK培养基上的菌落大于CHROMagar培养基上的。
2.3 实际样品检测 40份实际样品检测出的阳性菌株经VITEK32的GNI+ 鉴定，结果详见表2。
表2 三种培养基检测40份样品中沙门菌结果比较
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样品名称 |
份数 |
DHL培养基 检出数（%） |
CHROMagar检出数（%） |
HK培养基检出数（%） |
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熟食 |
20 |
16（80.0） |
13（65.0） |
17（85.0） |
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牛奶 |
10 |
9（90.0） |
9（90.0） |
9（90.0） |
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生鸡肉 |
10 |
9（90.0） |
9（90.0） |
9（90.0） |
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总计 |
40 |
34（85.0） |
31（77.5） |
35（87.5） |
3 讨论
沙门菌广泛存在于自然界中，主要是通过食品(特别是动物性食品)传播、感染人体。国标法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点，已远远不能满足现代检测要求。显色培养基法的原理是使用适当的荧光或显色底物，在细菌特异性酶作用下，产生荧光或显示一定颜色，用紫外灯观察细菌产生的荧光或直接观察菌落颜色，减少对菌株进行纯培养和生化鉴定步骤，可以把检测、计数和鉴定一次完成，缩短检测周期。
HKM和CHROMagar 培养基上的沙门菌呈现品红或紫色的菌落与各自特异的酶底物和显色剂有关。两种培养基均能抑制金黄色葡萄球菌的生长，大肠杆菌、费氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌等杂菌或被抑制或菌落颜色与沙门菌有明显差别。在CHROMagar培养基上，嗜水气单胞菌和铜绿假单胞菌与沙门菌菌落颜色无法区别，而HK显色培养基对这两种菌有良好的抑制作用。从4种沙门菌的涂布培养结果可见，伤寒沙门菌在CHROMagar培养基上的菌落较大，而HK培养基对某些沙门菌检测的灵敏度比CHROMagar培养基多数倍，菌落直径也明显较大。
在实际样品检测中，3种培养基对牛奶、生鸡肉中沙门菌的检出率相同，而对熟食样品检出率差异较大，原因可能是熟食在生产加工的过程中添加的有机和无机成分种类多且复杂，影响了酶与底物的反应，同时熟食较牛奶和生鸡肉杂菌污染量大，使检测结果出现一定比例假阳性或假阴性，从而干扰目标菌的检测，降低显色培养基的敏感性和特异性。
综上所述，显色培养基在微生物检测中的应用，可大大提高测效率，满足应急需要。
作者：朱海明 ，赖蔚苳，卢勉飞，杨冰 ，王海燕 ，柯昌文 ，严纪文 ，王建
参考文献：
[1]余泼．医学微生物学[M]．北京：人民卫生出版社，1983，303 305．
[2]吴清平，周艳红，蔡芷荷．卫生微生物特异性显色培养基的研究与应用[J]．中国卫生检验杂志，2005，15(1)：124—126．
[3]卢勉飞，吴清平，刘云林，等．特异性酶反应在食源性致病菌检测中的应用[J]．中国卫生检验杂志，2005，15(3)：354～356
