显色培养基在单核细胞增生李斯特菌快速检测中的应用研究（1）

 [摘要] 目的：研究显色培养基对单核细胞增生李斯特菌的检测效果，探讨建立新型快速检测方法。方法：检测按国标GB4789—33程序进行。结果：人工污染样品和实际样品检测中，显色培养基CHROMagar Listeria和HKListeria与传统平板OXA和MMA可以达到相同的检测限和灵敏度，且具有更高的特异性。结论：用显色培养基检测单核细胞增生李斯特菌是一种新途径，可大大提高检测效率。

[关键词] 显色培养基；单核细胞增生李斯特菌；快速检测              

单核细胞增生李斯特菌(简称“单增李斯特菌”)是一种重要的食源性致病菌，广泛存在于肉类、禽类、乳制品等食品中，引起新生儿脑膜炎和成人败血症等疾病，是食品微生物的常检项目之一。美国食品和药品管理局(FDA)、美国农业部(USDA)、ISO11092标准、国际分析委员会(AOAC)和中国国标(GB4789—33)等都建立了各自的检测方法，所用培养基包括OXA、PAL、MMA、MOX、TSA—YE等，但只适用于李斯特菌的选择性分离培养，不能特异性分离单增李斯特菌。目前仍需一种选择性平板可以有效的分离单增李斯特菌。鉴于此，一些显色培养基如CHROMagar Listeria(法国科玛嘉)、HKListefia(广东环凯)等不断开发出来，用于单增李斯特菌的快速检测中，直接根据菌落颜色和形态就可对菌种作出鉴定，大大缩短了检测时间，提高了检测效率。本文通过对人工污染样品和实际样品检测，比较了CHROMagar Listeria、HKListeria与传统平板OXA、MMA的检测效果。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

单增李斯特菌Listeria monocytogenes ATCC94002、大肠杆菌Escherichia coli 8099、沙门菌Salmonella typhi、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus、粪链球菌Enterococcus faecalis、英诺克李斯特菌L.innocua(简称“英诺克”)、威尔李斯特菌L.welshimeri(简称“威尔”)分离株由广东省微生物研究所微生物检测新技术发展中心提供。

1.2 培养基及试剂

HKListeria、CHROMagar Listeria、OXA、MMA、TSA-YE、LB1、LB2李斯特菌增菌液、萘啶酮酸、丫啶黄、李斯特菌生化鉴定管等由广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.3 主要仪器

法国生物梅里埃公司Biomerieux全自动微生物鉴定系统，API Listeria生化检测试剂条。

1.4 样品

试验所用样品猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉、熟食、蔬菜、蛋糕等，均采集于附近超市和肉菜市场。

1.5 方法

1.5.1 培养基制备  HKListeria、CHROMagar Listeria、OXA按生产厂家的说明书制备，MMA、TSA-YE按国标GB4789-33法配制。

1.5.2 显色培养基特异性检验   将单增李斯特菌、英诺克、威尔、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、粪链球菌在脑心浸液琼脂，大肠杆菌、沙门菌在营养琼脂培养基上培养24 h后，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA、MMA培养基，37℃培养24 h，观察。

1.5.3 显色培养基灵敏度检验  (1)挑取1环单增李斯特菌加到10 ml 0.85％ 生理盐水中配成原液，然后进行10倍梯度稀释，取10^-4、10^-5、10^-6 菌液各100ul ，分别涂布HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和TSA-YE平板。37℃ 培养36h，计数菌落数。(2)取单增李斯特菌10^-3～10^-8浓度菌液，分别加入2．1×10⁴cfu／ml金黄色葡萄球菌、1.4×10⁴ cfu／ml蜡样芽孢杆菌、1.6×10⁴ cfu／ml大肠杆菌和1.3×10⁵cfu／ml粪链球菌，震荡混匀，取100分别涂布HKListeria、CHROMagarListeia和OXA平板，以10^-3～10^-8 纯菌液涂布TSA-YE做对照，37℃培养36 h，计数单增李斯特菌菌落数，比较在干扰菌株浓度较高而目标菌较低时各培养基的灵敏度。

1.5.4 人工污染样品

1.5.4.1 纯菌污染样品检测：将单增李斯特菌梯度稀释后，取10-3—10-8“菌液各1 ml，分别加入到10 g猪肉和9 ml牛奶中，均匀混合2 h。按国标GB47893—33方法增菌，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA培养基，37℃ 培养24 h，观察单增李斯特菌在各培养基上的检出情况。

1.5.4.2 单增李斯特菌和非李斯特菌混合污染样品检测：将单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门菌、粪链球菌近似等比例混合后，10倍梯度稀释成10-3～10-8 不同浓度的混合菌液，各取1 m1分别加入到10 g猪肉和9 ml牛奶中，按国标GB47893—33增菌后，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA培养基，37℃ 培养24 h，观察单增李斯特菌在各培养基上的检出情况。

1.5.4.3 单增李斯特菌、英诺克和非李斯特菌混合污染样品检测：由于样品中李斯特菌数量一般较少，约1—10 cfu／ml，而英诺克是单增李斯特菌的主要竞争菌，其他李斯特菌对单增李斯特菌影响不大，因此将单增李斯特菌和英诺克按100 cfu：10 cfu、10 cfu：10 cfu和10 cfu：100 cfu 3种近似比例混合，然后加入(10⁴ -10⁵ )cfu／ml金黄色葡萄球菌、(10⁴ -10⁵  )cfu／ml蜡样芽孢杆菌、(10⁴ -10⁵)cfu／ml大肠杆菌、(10⁴ -10⁵  )cfu／ml沙门菌、(10⁴ -10⁵  )cfu／ml粪链球菌，制成混合菌液，分别加入到9 ml牛奶和10 g猪肉中，按国标GB47893— 33法，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA平板，37℃培养24 h，观察单增李斯特菌在各培养基上的检出情况。

1.5.5 实际样品 从市场购买实际样品共62份，按国标GB4789—33增菌，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA平板，观察李斯特菌的检出情况。

1.6 分离鉴定

将疑似菌落进行纯化，用法国生物梅里埃公司API Listeria试剂条，并结合传统生化鉴定方法进行鉴定。

2 结果

2.1 显色培养基的特异性

显色培养基特异性检验结果如表1。HKListeria、CHROMagar Listeia具有较好的特异性，单增李斯特菌呈现蓝色带白色晕环的菌落，威尔和英诺克李斯特菌呈现蓝色无晕环菌落；金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌在CHROMagar Listeia上略有生长，呈现绿色无晕环菌落，菌落形态与单增李斯特菌也有明显区别；在上述两种显色培养基上大肠杆菌和沙门菌等革兰阴性菌均被抑制。与显色培养基相比，OXA、MMA特异性较差，不能特异区分单增李斯特菌。

表1 不同菌株在各种培养基上的生长情况

2．2 显色培养基灵敏度检测结果

单增李斯特菌10^-4、10^-5、10^-6 纯菌液在各培养基上的生长情况如表2。对各培养基上的菌落数进行方差分析，P>0.05，表明HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和TSA-YE对单增李斯特菌的检出率无显著差异，其灵敏度相当；单增李斯特纯菌10^-3-10^-8 菌液混合金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌和粪链球菌后，涂布平板的结果如表3。方差分析结果表明，P>0.05，4种培养基的灵敏度相当，当有高数量杂菌存在时同样可以达到相同的检测限。

表2 单增李斯特菌在各个培养基上的生长情况(Mean±Sd)

表3 非李斯特干扰菌存在下各培养基上单增李斯特菌数(Mean±Sd)

TSA—YE上为单增李斯特菌纯菌液的涂布结果(对照)

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