细菌菌落总数检测常见误差原因分析

细菌菌落总数是微生态制剂样品检测必做的一项指标。菌落总数检测同其他检验一样，也存在检测误差。平板计数法是检测饲料中细菌总数、活酵母数、芽孢杆菌数及乳酸菌数的常用方法之一，因此，该值准确与否直接关系到微生物饲料添加剂类产品的质量好坏。微生物平板计数的通常方法为每个样品用 3个稀释度，每个稀释度常做 3个重复。但如何对平板菌落进行正确计数、3个稀释度以哪一个稀释度进行计数及微生物检测允许误差等问题，在饲料标准中并未有所规定，而这些问题与统计值的准确性密切相关。我们就实际检测芽孢杆菌工作中遇到一些菌落计数的问题，与大家进行探讨。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1样品：随机抽取微生态饲料添加剂合生素样品3份。

1.1.2 培养基：营养琼脂。

1.1.3仪器设备：磁力搅拌器，无菌培养皿，培养箱，振荡器。

1.2 试验方法

1.2.1样品的振荡时间对菌数检测的影响

选择1个样品，称取10 g，放入无菌锥形瓶内，加入90 mL无离子水，磁力搅拌分别为l0、20、30、40和60 min。

用1 mL移液枪从中吸取1 mL样品悬浊液加入到盛有9 mL去离子水的试管中，用振荡器使样品充分均匀，以此类推，制成10^-1～1O^-7不同稀释度的样品溶液。

平板涂布法检测菌含量：用移液枪从样品稀释液中各吸取200uL，每个样品稀释液3个重复；将平板倒置于35-37℃培养箱中培养24 h。

1.2.2 检测方法对菌数检测的影响

各个样品称取l0 g，放入无菌锥形瓶内，加入90 mL无离子水，磁力搅拌分别为40 min。并稀释成10^-1～l0^-7 不同稀释度的样品溶液。

倾注平板法检测菌含量：用移液枪从各个平行样品相应稀释液中各吸取1 mL，每个样品稀释液3个重复，待培养基表面干燥后，将平板倒置于35-37℃培养箱中培养24 h。

平板涂布法检测菌含量：用移液枪从各个平行样品相应稀释液中各吸取200uL涂布平板，每个样品稀释液3个重复；将平板倒置于35～37℃培养箱中培养24 h。

2结果

2.1样品的振荡时间对菌数检测结果的影响

采用细菌平板计数的方法，不同振荡时间对合生素中芽孢杆菌检出量的结果见表1。从表l中可见：不同振荡时间获得的细菌菌落数量有较大差别。总体而言，在一定时间内，随着振荡时间的延长检出有效菌含量增加，说明细菌从载体上解析需要一定的时间；当振荡时间为40 min后产品中的菌含量基本稳定。采用适当振荡时间才能更精确的显示产品中有效菌的含量。

表1 震荡时间对有效菌含量结果的影响  亿CFU／g    

2.2 检测方法对菌数检测结果的影响

表2 检测方法对有效菌含量结果的影响 亿CFU／g

采用不同的检测方法，对合生素中芽孢杆菌检出量的结果见表2。从表2可见：不同方法获得的细菌菌落数量有差别，倾注平板法相较平板涂布法检测的菌含量多，但基本在20％误差范围内。平板计数法操作相对简单、快捷且影响因素较少。倾注法培养基营养分布较均匀，对部分蔓延菌落能控制，但对操作人员熟练程度要求相对较高。

3分析与讨论

3.1样品处理对结果的影响

取样时对样品取样口和取样工具要消毒，防止样品交叉污染。

3.2样品的均质处理对结果的影响

固体样品要用均质器或玻璃珠等充分均质，也可在稀释液中添加相应溶解液（如吐温80和液体石蜡等）的稀释液，以保证样品的充分均质。

测定芽孢杆菌活菌数时，不同振荡时间获得的细菌菌落数量有较大差别，因为细菌从载体上解析并均匀分散到溶液中需要一定的时间，待测样品应在振荡器上充分振荡，使得芽孢杆菌可以充分和均匀地分散到待测溶液中，避免因为菌体未完全释放而引起结果中细菌含量偏低的现象。

3.3 试验过程中操作方法的影响

加样l mL时，用1 mL的吸管并且每做一个稀释度都要换1支吸管，否则稀释度间菌落计数误差会超过10％，说明存在操作误差。用吸管向平皿里加样，平皿开口要小，吸管要直立且加样结束后，让吸头接触皿底干燥处，保证加样的体积不少。

若采取倾注平板法时，平皿加样后要及时倾注琼脂，其间隔一般不超过20 min （最好在10 min内)。以琼脂不烫手(约45℃)为宜，否则会杀灭细菌，太热也会使冷凝水过多，影响细菌的生长。加入琼脂要及时摇匀，先向一个方向旋转，然后向另一方向旋转。这样会减少菌落的集聚和连片现象。另外，用力不要过大，使琼脂不溅到皿壁和皿盖上，保证计数结果的准确。当琼脂凝固后，要及时移入培养箱倒置培养。若采用涂布平板法进行检测，放置适当时间后，则立即将平皿翻转后放置培养箱中进行培养，以避免菌落蔓延生长，难以计数。

为保证结果准确，除作琼脂的空白对照外，还要对菌落计数的全程做一对照。

3.4 菌落计数误差

菌落计数在完成培养后应立即进行，以防菌落继续生长蔓延从而影响测定结果。培养基中加入TTC（氯化三苯四氮唑)可使细菌菌落显红色，这样可与同样品颗粒和凝集物(白色)相区分，以提高菌落计数的准确性。有学者认为：100 mL培养基中加入2～3 mL的TTC可使菌落着色且不抑制细菌的生长。

菌落计数时要2个人分别用菌落计数器计数菌落总数，取2个人的平均数报告菌落总数。

一般来说，每平板含20～200个菌落的稀释度的菌含量与实际结果最接近，超过200个／平皿或小于2O个／平皿的计数结果则可能与实际存在较大差别。因此，应尽量选择20～200个／平皿的稀释度进行芽孢杆菌的计数，保证菌落计数的有效性。报告结果要遵守国标中菌落计数的方法进行。

4小结

菌落数检测的误差可能来自于多个方面。试验研究表明：除了检测环境和培养基之外，误差主要来自于样品和检验的操作过程，包括检验的准备环节。一般认为，微生物样品不能复检。但当菌落总数在标准的临界或菌落出现明显的异常时，有时重新检测还是必要的。这里所提到的重新检测是对同一批次未开封且保存的时间和温度都比较合适的样品。这样，可以通过重新检测校正误差。

作者：孙笑非 李超

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