向日葵菌核病拮抗菌 XRK5 的筛选与鉴定

摘   要:  从向日葵根际分离了640个细菌分离物,以向日葵菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)为靶标菌, 通过平板对峙法获得了18个具有拮抗性能的细菌,其中 XRK5 具有较强拮抗能力,且拮抗性能稳定,具有较好的生防应用潜力。经过形态观察、生理生化特征及16S rRNA 序列分析,将XRK5 鉴定为辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici), XRK5 的 16S rRNA 序列在 GenBank 中的注册号为FJ959348。

关键词: 向日葵菌核病,拮抗细菌,鉴定

菌核病是一种世界性真菌病害,其病原菌——核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)以菌核的形式在土壤中越冬越夏,当温度及湿度条件适宜时,菌核萌发产生子囊盘,散发的子囊孢子侵染植物,可寄生450 多种植物。在我国的东北、内蒙古、山西、西北等地向日葵菌核病危害严重。向日葵感染菌核病菌后,产量下降,皮壳率增加,籽仁蛋白质及油率下降,发病后子粒失去了实用价值和商业价值,  极大地影响了向日葵种植业的发展。

向日葵菌核病当前的主要防治措施是化学防治,但其效果不理想、防治成本高、还造成环境污染。由于核盘菌寄主范围广泛,病菌以菌核形式长期存活于土壤中,当条件(温、湿)适宜时菌核萌发产生子囊盘,散发的子囊孢子由气流传播构成初侵染源,这种流行特点给菌核病的控制带来了极大的困难 。对菌核存活的生物学研究表明,土壤中的生物因子是影响菌核存活的主要因子,另外,生物防治的方法还可以减少化学农药带来的环境污染,因此利用某些生物因子防治菌核病值得深入研究。有关向日葵菌核病生防方面的报道甚少,目前已报道的具有一定生防应用潜力的菌核寄生菌只有盾壳霉(Coniothyrium minitans),木霉 (Trichoderma spp.),粘帚霉(Glioclaclium spp.),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 等少数菌种。

本实验从向日葵根际筛选出一株对核盘菌有高效和稳定拮抗能力的细菌,  具有较好的生防应用潜力,命名为XRK5,并被鉴定为辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici)。

1   材料和方法

1.1  材料

供试病原菌: 向日葵菌核病菌(Sclerotinia scle-rotiorum)由本实验室保存。

培养基: 马铃薯蔗糖培养基(PSA),牛肉膏蛋白胨培养基(NA),高氏一号培养基, LB 培养基。

试剂:  分子生物学试剂和 3S 柱离心式琼脂糖DNA 小量快速纯化试剂盒(3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit)购于上海申能博彩生物科技有限公司。

土壤样品:  从内蒙古巴彦淖尔盟乌拉前旗采集的 6 份向日葵根际土样。

1.2    拮抗菌的分离与筛选

采用样品梯度稀释法得到分离物:准确称取向日葵根际土样 10 g放入装有 90 mL无菌水并放有玻璃珠的三角瓶中,振荡 20 min后静置 20-30s,即得10^-1稀释液,然后利用梯度法分别稀释成 10^-2 到10^-9的稀释液。各取 0.1 mL 的稀释液(10^-5 、10^-6 、10^-7、 10^-8 )分别涂布于 LB 和 PSA 培养基上,  各取0.1 mL 稀释液(10^-3 、10^-4 、10^-5 、10^-6 )涂布于高氏一号培养基上。LB 培养基 37℃ 培养, PSA 和高氏一号培养基 28℃培养, 待其长出分离物。

采用平板对峙法筛选拮抗菌:将马铃薯蔗糖培养基倒平板,用灭菌解剖刀将活化好的病原真菌切成边长约为 1cm 的正方形状,置于平板中央,于28℃ 培养 2-3 d,待病原真菌长到直径为 2cm 时,用接种环挑取分离物,从靠近病原真菌的一侧沿与其生长方向相交的方向划线接种,每个培养皿接种6-8个试验菌,于28℃培养24-48h,  根据有无抑菌带及抑菌带的大小判断其拮抗效果。

1.3  XRK5 的鉴定

形态特征和生理生化特征的测定方法参阅文献 。

1.4  PCR 扩增 16S rRNA 序列

以细菌总 DNA 为模板, 27F (5′-GAGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′)和 1495R (5′-CTACGGCTA CCTTGTTACGA-3′) XRK5 16S rRNA作引物扩增 的PCR : 95℃ 5 min; 94℃ 1 min, 序列。 反应条件为56℃ 1 min, 72℃1.5 min, 30 个循环; 72℃10 min。用 3S  柱离心式琼脂糖 DNA 小量快速纯化试剂盒(3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit)纯化 PCR 产物。

1.5  16S rRNA 序列测定及分析

测序由上海博尚生物技术有限公司完成。测序结果用NCBI  数据库中的BLAST 进行相似性分析,采用MEGA 4.0程序的Neighbor-joining算法构建系统发育树。

2   结果与分析

2.1   拮抗细菌的筛选

从 6 份向日葵根际土样中得到 640 个细菌分离物,  经过初筛、复筛获得 3 株具有良好拮抗作用的细菌分离物,其中一株命名为 XRK5,  其抑菌圈直径可达 10 mm-15 mm (见图 1),  经多次实验验证其抑菌效果较为稳定。

2.2  XRK5 的形态学特征

XRK5 的菌体大小为(0.8-0.9)μm×(3.5- 5.0)μm,  其最大生长长度可达 50 μm以上(如图 2所示),  革兰氏染色阴性,兼性厌氧,长杆状,在 LB平板上生长 24 h 后,菌落为奶油色,粘稠厚重,不透明,表面湿润光滑,边缘规则。

2.3  XRK5 的生理生化特征

根据已报道的几类溶杆菌的生理生化特征进行实验 ,结果显示, XRK5 与已报道的 L. capsici YC5194和L. capsici KCTC22007的生理生化特征相同,比如:  不能氧化分解葡萄糖,能产生胰蛋白酶,也能产生α-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶,可以水解七叶苷, 不能水解马尿酸盐,不能以麦芽糖为碳源,柠檬酸盐实验呈阳性,不产生 β-半乳糖苷酶等。

XRK5 的生理生化特征如表 1 所示。

表1 生理生化特征

注：+：阳；-：阴；ND：未测定

2.4    16S rRNA 序列分析

用引物 27F 和 1495R PCR 扩增 XRK5 的16S rRNA 序列, PCR  产物经 1%琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像如图 3 所示。 经测序分析 XRK5扩增的16S rRNA  序列长为1400 bp, 将得到的序列提交 GenBank 获得注册号FJ959348。将 XRK5的16S rRNA 序列进行 BLAST分析,结果显示, XRK5与 Lysobacter capsici  55 (FN357198)的相似性最高,达到了100%,与 L. an-tibiotics HS124 (FJ930928)的相似达到了99%。

将 XRK5 的 16S rRNA 序列在 NCBI 数据库中进行 BLAST 分析后,构建系统发育进化树。如图 4 所示, XRK5 与 L. capsici 55 和 L. antibiotics HS 124 处于最小分支。我们根据 XRK5 的16S rRNA 分析,结合其生理生化特征,将 XRK5鉴定为 L. capsici。

3   讨论

利用拮抗菌防治向日葵菌核病是生物防治的重要手段之一,并且此方法具有不污染环境,不产生抗性,仅杀伤或抑制防治对象,能参与生态环境的调控，保持生态平衡能起到长效作用等优点。因此,筛选更多具有高效、稳定拮抗能力的拮抗菌对菌核病的防治具有十分重要的意义。

本实验从向日葵根际土壤筛选到了一株具有较好应用潜力的拮抗菌菌种资源 Lysobacter capsici  XRK5, 经过多次拮抗实验证明此株菌均表现出稳定的拮抗性。Lysobacter capsici 为 2008 年发现的新种,其对向日葵菌核病的防治国内外均未见报道。本实验对 XRK5 的分类鉴定和拮抗效果进行了初步的研究,  其拮抗物质鉴定和拮抗机理的研究尚需进一步的实验证明。本研究结果为构建高效的基因工程菌和研制向日葵菌核病生防制剂奠定了良好的基础。

作者：侯启会  杜秉海  靳奉理  王雪  张浩文  丁延芹  姚良同 

(山东农业大学生命科学学院  农业微生物重点实验室   山东  泰安  271018)

参考文献（略）

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