禽流感病毒检测方法

缩写：

AI - 禽流感

PCR - 聚合酶链式反应

RT-PCR - 反转录聚合酶链式反应

NASBA - 核酸序列扩增

ATCC - 美国菌种保藏中心

PLA - 接近黏合法

NP - 纳米粒子

fM - femtomolar毫微微摩尔

TCID₅₀ - 组织培养感染剂量中位数

    高致病性禽流感病毒（AI）由于人畜共患传染而成为现在对公众健康构成重大威胁的病毒。它给卫生服务带来了额外的负担，并且由于禽类患病而影响企业利益，而这最终会给国家和世界的经济带来负面影响。最近由于高致病性禽流感病毒AI而引起的野生鸟类和养殖家禽禽流感的重新爆发表明我们迫切需要快速、敏感的检测方法。迄今为止，基于PCR和抗原的检测禽流感病毒的方法是用的最多的方法。另外，基于核酸扩增的方法也在开发以希望能提高灵敏度和特异性，这就是核酸序列扩增和基因芯片技术。

    PCR 和 RT-PCR

    基于PCR的检测技术是禽流感诊断中最常用的方法。传统的反转录PCR（RT-PCR）和实时定量RT-PCR方法常用于识别禽流感病毒毒株。实时定量PCR技术在诊断方面的应用比传统的反转录PCR方法更具优势。其优点包括以下3个方面但又不仅局限于此：

• 降低了由于缺乏后续处理技术而导致PCR扩增产物转接的风险；
• 更高的精度与更短的周转时间相结合提高了吞吐能力；
• 自动化。

    现在已经报道了许多基于实时定量PCR的诊断方法，例如霍夫曼等人就在2007年报道了一种诊断方法可以快速、特异的诊断青海血统的HPAIV病毒H5N1毒株，因为它结合了一个裂解位点，不用测序就可直接分析。

    最近，Muradrasoli等（2010）报道了一种以测定人和动物的A、B 和 C三种流感病毒核蛋白基因为目标的三重荧光实时定量PCR方法研究进展。此法利用了一种新型不匹配容错分子信标，同时也是荧光定量的探针，它可以允许在探针测定范围内的核苷酸变异。当检测各种样品时，这种方法比荧光探针PCR表现了更高的敏感性。与荧光探针PCR相比，这种方法能检测到病毒总RNA或者总cDNA的十分之一的样品。总的来说，由于具有简单性和可靠性等特点基于反转录PCR的方法已经成为目前主要的诊断方法。最近Schlingemann等（2010）报道了一种可在生物样本中检测病毒抗原的PCR替换方法。PLA是一种新的方法可通过核酸扩增来检测蛋白质。这种方法是利用了当一些抗病原体表面蛋白抗体接近时细菌表面蛋白抗体通过连接体与DNA双链相结合。它通过DNA双链来测定目标蛋白，而DNA双链可以在实时定量PCR中得到扩增。这种利用禽流感病毒特异性核蛋白单克隆抗体的方法与常规参考的实时定量PCR方法相比具有很高的特异性，因为它消除了提取核酸的必要性。另外，这种方法可以使用失活的样品，这样样品就可以安全的从现场送到实验室。虽然这是一种刚刚建立的方法，但是由于它能在复杂的生物样品中检测微含量的病原体蛋白而使它成为最具潜力的替代方法。

    快速可靠的检测技术可以在早期成功的检测到病毒。病毒的DNA序列在成功预防这种疾病过程中起到重要作用。为了实现这一目标，一种基于超级对流原理的核苷酸测序技术和快速PCR技术相联合的方法建立起来了（Yacoub等2009年报道）。来自广谱禽流感病毒的HA基因通过一步法实时定量PCR反应得到扩增，接下来进行涵盖HA基因裂解位点的快速测序。测定序列和病毒致病性的评估包括HA基因的序列信息，这些步骤在2小时之内都能完成。这种革新的方法被认为是在处理高通量样本，特别是处理监测点现场样品时，是一种低成本、高效率及实用的方法。

    NASBA方法

    检测RNA分子的方法是反转录PCR（RT-PCR）。多轮热循环后就是反转录反应，这样既费时又因为转移污染而易造成假阳性。核酸序列扩增法（NASBA）是一种从双链DNA扩增mRNA的单步等温RNA扩增过程；这种替代方法是最近在2002年由柯林斯等人建立起来的。这种方法能在欧洲血统的血液中分离出禽流感A型H5亚型，有趣的是，柯林斯等人又在2003年设计了另一种NASBA法可以检测禽流感病毒H7亚型。这种扩增方法在等温下中实现并同时使用三种酶：禽类成髓细胞血症病毒反转录酶、T7 RNA聚合酶和核糖核酸酶H并结合2个特别设计的DNA寡核苷酸引物。这个扩增步骤是紧跟着电化学发光检测的。这个NASBA方法被证明有很高的敏感性和特异性。最近，一款用在临床样品的快速诊断H5N1病毒的商业化NASBA被开发出来（摩尔等，2010）。尽管NASBA方法是快速的，但是由于在室内准备NASBA混合剂的困难和商业试剂盒成本太高，这种方法并没有得到广泛应用。

    基因芯片技术

    基因芯片技术被证明是病毒检测和分型最有力的一种工具。它允许同时检测很大变异遗传元件。举个例子，据报道它在检测A/H5N1, A/H3N2和A/H1N1病毒株时的临床敏感性时95%，特异性是92%（道森等人，2007）。另外一种类型的基因芯片，低密度基因芯片也值得一提。低密度基因芯片利用的是NanoChip400系统（Nanogen公司产品）， 它有一个M基因的探针和97个HA基因的裂解位点基因探针，它被认为是检测H5N1病毒的一个可靠地工具（高尔等人，2009）。值得一提的是，这里提到的检测极限可以比实时定量PCR低10到100倍。但是，上述方法所涉及的多个步骤，像一些扩增步骤，探针标记和标记的核苷酸掺入到DNA中等使得这种方法费时、费力而且价格非常昂贵。另外，引物设计的优化和成千上万种探针的设计对科学家也是一种挑战。因此，基因芯片技术排在反转录PCR之后。

    最近，赵等人（2010）报道了一种快速，简便的黄金纳米粒子（NP）基因组PCR方法，它可以无需设计基因芯片就可特异识别禽流感病毒H5N1。它还可以区别H5N1和其他主要的流感病毒A型病毒株像H1N1 和 H3N2。这种方法使用无酶扩增捕获目标的中间寡核苷酸杂交与黄金纳米粒子（NP）介导的银染相结合可以在2.5小时内检测到病毒RNA。这种检测的最低极限对纯化的PCR产物来说是低于100 fM，对病毒RNA是10³ TCID₅₀单位。这是一种新的方法，到目前为止还没得到广泛应用。

    总结

    总之，分子生物学方法有很多优点，如较高的特异性和灵敏度，复合形式，能够适应任何样品类型，最小的接触传染性样品，快速周转时间，和高吞吐量等优势。一般来说，RT - PCR技术仍旧是用在禽流感检测中的主要技术手段，目前，在分子生物学检测方面，由于对技术要求水平适中、相对便宜和快速的样品筛查等优点实时定量反转录PCR技术成为应用最广泛的技术。但是，禽流感检测方法的最终选择取决于实验室能力和设施。上述所提所有方法的主要缺点是设备运行的高成本。另一个缺点是，所报告的方法只验证了传播的禽流感病毒株。为了确保足够的效率和可靠性，所有的方法必须通过现场的验证。不过，利用分子生物学技术获得的一个阳性结果对快速应急处理工作是很重要的，尽管这还需要病毒毒株分离工作的支持。

    引用文献

1. Hoffmann B, Harder T, Starick E, Depner K, Werner O, Beer M. Rapid and highly sensitive pathotyping of avian influenza A H5N1 virus by using real-time reverse transcription-PCR. J Clin Microbiol 2007, 45(2):600-603.
2. Muradrasoli S, Mohamed N, Belak S, Czifra G, Herrmann B, Berencsi G, Blomberg. Broadly targeted triplex real-time PCR detection of influenza A, B and C viruses based on the nucleoprotein gene and a novel "MegaBeacon" probe strategy. J. J Virol Methods. 2010 Feb;163(2):313-22.
3. Schlingemann J, Leijon M, Yacoub A, Schlingemann H, Zohari S, Matyi-Toth A, Kiss I, Holmquist G, Nordengrahn A, Landegren U, Ekstrom B, Belak S. Novel means of viral antigen identification: improved detection of avian influenza viruses by proximity ligation. J Virol Methods. 2010 Jan;163(1):116-22.
4. Yacoub A, Kiss I, Zohari S, Hakhverdyan M, Czifra G, Mohamed N, Gyarmati P, Blomberg J, Belak S. The rapid molecular subtyping and pathotyping of avian influenza viruses. J Virol Methods. 2009 Mar;156(1-2):157-6.
5. Collins R, Ko L, So K, Ellis T, Lau L, Yu A. Detection of highly pathogenic and low pathogenic avian influenza subtype H5 (Eurasian lineage) using NASBA. J Virol Methods 2002; 103: 213-225.
6. Collins RA, Ko LS, Fung KY, Chan KY, Xing J, Lau LT, Yu AC. Rapid and sensitive detection of avian influenza virus subtype H7 using NASBA. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Jan 10;300(2):507-15.
7. Moore C, Telles JN, Corden S, Gao RB, Vernet G, Van Aarle P, Shu YL. Development and validation of a commercial real-time NASBA assay for the rapid confirmation of influenza A H5N1 virus in clinical samples. J Virol Methods. 2010 Dec;170(1-2):173-6.
8. Dawson ED, Moore CL, Smagala JA, Dankbar DM, Mehlmann M, Townsend MB, Smith CB, Cox NJ, Kuchta RD, Rowlen KL. MChip: a tool for influenza surveillance. Anal Chem 2006, 78(22):7610-7615.
9. Gall A, Hoffmann B, Harder T, Grund C, Hoper D, Beer M. Design and validation of a microarray for detection, hemagglutinin subtyping, and pathotyping of avian influenza viruses. J Clin Microbiol 2009, 47(2):327-334.
10. Zhao J, Tang S, Storhoff J, Marla S, Bao YP, Wang X, Wong EY, Ragupathy V, Ye Z, Hewlett IK. Multiplexed, rapid detection of H5N1 using a PCR-free nanoparticle-based genomic microarray assay. BMC Biotechnol. 2010 Oct 13;10:74.

上一篇：λ噬菌体的大规模培养：低倍数感染

下一篇：禽流感病毒检测方法—NASBA技术