显色培养基快速检测大肠菌群和大肠杆菌效果的研究

【摘要】 目的  评价大肠菌群(Coliform)和大肠杆菌(Escherichia coli)复合显色培养基(CCEA)的检测效果。

方法   本实验室研究的显色培养基CCEA与经典培养基结晶紫中性红胆盐琼脂培养基(VRBA)和国外两种同类商品化显色培养基(Agar I和Agar II)作对比，分别对11种质控菌株、添加大肠杆菌或大肠菌群的13种无菌样品以及4种实际样品进行检测，对检测结果进行统计分析，以及观察对实际样品检测的符合率情况。

结果   CCEA具有良好的选择性；对7种质控菌株检验结果的分析，CCEA与VRBA和Agar II比较无统计学意义；CCEA比Agar I长出菌落数略多，有统计学意义。对13种无菌样品中添加大肠杆菌或大肠菌群检验结果的分析，CCEA比VRBA长出菌落数略多，有统计学意义；CCEA与Agar I和Agar II比较无统计学意义。对4种实际样品中大肠菌群检验结果的分析，CCEA与VRBA、AgarI和Agar Ⅱ比较无统计学意义；大肠菌群经验证总体符合率分别为90％ 、71.88％ 、86.25％和81.25％，即符合率大小为CCEA>Agar I>Agar Ⅱ>VRBA。对4种实际样品中大肠杆菌检验结果的分析，CCEA与Agar I和Agar II比较无统计学意义；大肠杆菌经验证总体符合率均为100％。结论本实验室研究试制的显色培养基CCEA优于经典培养基VRBA并与国外两种同类显色培养基Agar I和Agar II总体检测效果无统计学意义。

【关键词】培养基； 大肠杆菌； 肠杆菌科

大肠菌群是指一群在37℃培养24 h能发酵乳糖产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽胞杆菌，包括埃希菌属(大肠杆菌)、肺炎克雷伯菌属、柠檬酸杆菌属和肠杆菌属。大肠菌群主要来源于人畜粪便，故以它作为粪便污染的指标。若食品中大肠群菌数量越多，表示受粪便污染的程度越大，也就是受肠道中病原菌随粪便侵入的可能性越大，所以大肠群菌的检验用以评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。经典的大肠菌群尤其是大肠杆菌的检测方法存在检测程序比较繁琐、检测周期长等缺点。显色培养法是近段时间发展的一种检测和鉴别细菌新技术，其原理是人工合成无色底物由产色基团和微生物可代谢物质两部分组成，在特异性酶作用下游离出产色基团显示特定颜色，这种利用显色底物来测定特殊酶的活性，可直接观察菌落颜色即可对菌株做出鉴定。这种敏感的方法提高了检测的速度和正确性，优于初期分离的培养基。省略了为鉴别而必须先分离出纯培养物的过程，而且选择合适的合成底物可实现对几个不同生化反应进行同时检测据报道，绝大多数大肠杆菌具有β-葡萄糖醛酸酶，大肠菌群具有β-半乳糖苷酶。依据此原理，本实验室试制的大肠菌群和大肠杆菌显色培养基(CCEA)，与国外两种同类商品化显色培养基(AgarI和AgarII)均含有β-D-半乳糖苷显色底物和β-D-葡萄糖苷显色底物，大肠菌群和大肠杆菌利用不同的酶分别分解这两种底物，使不同色泽的色源游离出来显不同的色泽而区分大肠杆菌和其他的大肠菌群。这类显色培养基在国外已经广泛使用于食品中大肠菌群和大肠杆菌的同时快速检测，并已得到FDA、AOAC等官方的认可。大量的文献报道这种显色法具有高的敏感性和特异性，操作简便、快速，可大大节省人力和物力。为探讨显色法的实用价值，本实验室研究试制了CCEA培养基，并用该培养基与国外同类商品化产品以及经典方法测试了有一定代表性的菌株和食物样品，检测效果不错，现报告如下。

材料与方法

一、材料

1．培养基：大肠菌群和大肠杆菌显色培养基(CCEA，每L含蛋白胨15 g、酵母膏粉3 g、氯化钠5 g，十二烷基硫酸钠0.1g，琼脂12 g，混合色素6.77g，最终pH 7．0±0．2)、结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)、国外显色培养基(Agar I)、国外显色培养基(Agar II)、乳糖发酵管、月桂基硫酸盐胰胨(LST)肉汤、色氨酸肉汤(靛基质试验)、Koser枸橼酸盐肉汤MR—VP培养基、营养琼脂。

2．测试菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922、E．coli ATCC8739 E．coli GIM1.42、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)广临检-57、费氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)ATCC8090、产气肠杆菌(Enterobacter aerogen)CMCC45103、阴沟肠杆菌(E.cloacae)CMCC45301、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)CMCC50115、粪链球菌(Streptococci faecalis)CMCC32223、金黄色葡萄球菌(Staphylococci aureus)ATCC6538、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)GIM1.22。

3．无菌样品(13种)：牛奶、果冻、芒果糕、方便面、蛋糕、鸡蛋、奶品、八宝粥、冰棍、饼干、饮料、苹果汁。

4．模拟样品(无菌样品中添加质控菌株)：牛奶+(E.coliATCC25922)、牛奶+(C.freundiiATCC8090)、果冻+ (K.pneumoniae 广临检-57)、芒果糕+(K. pneumoniae 广临检-57)、方便面+(K.pneumoniae广临检-57)、蛋糕+[E.coli ATCC8739+E.cloacaeCMCC(B)45301]、鸡蛋+(E.coliATCC8739+E.cloacaeCMCC(B)45301)、奶品+ [E.coliATCC25922+E aerogenCMCC(B)45103]、八宝粥+(E coliGIM1.42+K. pneumoniae广临检-57)、冰棍+(E.coliGIM1.42+K.pneumoniae广临检-57)、饼干+[E.cloacaeCMCC(B)45301]、饮料+[E.aerogeCMCC(B)45103]、苹果汁+( K.pneumoniae广临检-57)。

5．实际样品(4种)：鸡肉、猪肉、冰棍、冰淇淋。

二、实验方法

1．测试菌株培养实验：将上述11种菌种复苏，分别挑取菌落置生理盐水进行连续10倍递减稀释，选择3个合适的稀释度，各取1 ml，倾注法分别接种于上述4种培养基的平板上，各接种3个平板，37℃ ，培养24 h。

2．模拟样品检测实验：按照GB／T 4789．2-2003对部分样品用营养琼脂进行细菌总数测定 ，选取13种细菌总数为0的无菌样品。无菌样品用生理盐水作1：10稀释，各挑取新鲜菌种的菌苔置生理盐水中制成含菌量约30—300 cfu／ml的稀释液，各取一定量加到已经10倍稀释的上述13种样品中，混匀，然后各取l ml倾注法分别接种于上述4种培养基的平板上，各接种3个平板，37℃，培养24 h。实验次数为1次，3个重复。

3．实际样品检测实验：4种样品分别用生理盐水作连续10倍递减稀释，选择合适稀释度的样品液各取0．1 m1分别涂布法接种到上述4种培养基的平板上，各接种3个平板，37℃ ，培养24 h。我们将采用乳糖发酵管(GB／T 4789．3-2003)法，挑取每个培养基平板上10个具有典型特征的菌落分别接种到乳糖发酵培养基，37℃ ，培养24 h，观察产气情况，并进行革兰染色，对大肠菌群进行确认 。采用商检法(SN 0169-92)法，从CCEA平板、Agar I平板和Agar II平板上分别挑取10个具有典型特征的菌落分别用一定量的生理盐水稀释，分别接种于月桂基硫酸盐胰胨(LST)肉汤、色氨酸肉汤(靛基质试验)、Koser枸橼酸盐肉汤和MR-VP培养基上，37℃ ，培养24 h，VP和LST实验培养48 h，MR和Koser枸橼盐实验培养96 h，并同时进行革兰染色，对大肠杆菌进行确认。符合率为经验证为大肠菌群或大肠杆菌的菌落数与显典型色泽的菌落数之比。实验次数为1次，3个重复。

结 果

1．测试菌株在CCEA、VRBA、Agar I和Agar II上培养结果比较：在CCEA平板上，大肠菌群和大肠杆菌菌落生长的典型性状分别为橙红色和蓝绿色；在VRBA平板上，大肠菌群和大肠杆菌生长菌落的典型性状均为红色；在Agar I平板上，大肠菌群和大肠杆菌生长菌落的典型性状为粉红色和绿色；在Agar II平板上，大肠菌群和大肠杆菌生长菌落的典型性状为淡蓝色和橙红色。

7种大肠菌群可以在这4种培养基上正常生长，并表现出典型特征；因这4种培养基均具有良好的选择性，3种革兰阳性细菌在这4种培养基上均不能正常生长情况；鼠伤寒沙门菌为革兰阴性细菌，均可在这4种培养基上正常生长，但不表现出大肠菌群典型的性状，可以与大肠菌群相区别。

对7种大肠菌群在CCEA和其他3种培养基上生长的菌落平均数进行t检验分析，CCEA与VRBA和Agar II比较无统计学意义(P>0.05)；CCEA比Agar I长出菌落数略多，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2．模拟样品在CCEA、VRBA、Agar I和Agar II上检测结果比较：对13种无菌样品中添加的大肠菌群在CCEA和其他3种培养基上生长的菌落平均数进行t检验分析，CCEA比VRBA长出菌落数略多，差异有统计学意义(P<0.05)；CCEA与Agar I和Agar II比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

3．实际样品中大肠菌群和大肠杆菌在CCEA、VRBA、Agar I和Agar II上检测结果比较：对4种实际样品中的大肠菌群在CCEA和其他3种培养基上

表1 七种大肠菌群在CCEA、VRBA、Agar I和Agar II培养基上培养结果

注：查表t(6)_0.05=2.45，上表t值大于2.45，则表示检验差异有统计学意义；反之，t值小于2.45，则表示检验差异无统计学意义。^a表示CCEA稍好.

表2  l3种模拟样品中的大肠菌群在CCEA、VRBA、Agar I和Agar II培养基上培养结果

注：查表t(12)_0.05=2.18，^a表示CCEA稍好。

生长的菌落平均数进行t检验分析，CCEA与VRBA、Agar I和Agar II比较差异无统计学意义(P>0.05)；大肠菌群经验证总体符合率分别为90％、71.88％、86.25％和81.25％ ，即符合率大小为CCEA>Agar I>Agar II>VRBA。在检验样品鸡肉时，在Agar I平板中，除显色的大肠菌群外，还有52.7％是无色菌，经国标法进行验证，证明这52.7％的无色菌均为大肠菌群，故用Agar I检测实际样品鸡肉时，显色的大肠菌群有0.97×10⁵cfu／g，加上不显色的大肠菌群共有2．05×10⁵cfu／g，即用Agar I检测实际样品鸡肉时，会存在严重的漏检(表3)。

对两种实际样品中的大肠杆菌在CCEA和其他两种培养基上生长的菌落平均数进行t检验分析，CCEA与AgarI和AgarII比较差异无统计学意义

表3 四种实际样品中的大肠菌群在CCEA、VRBA、Agar I和AgarⅡ培养基上培养结果

注：查表t(3)_0.05=3.18，括号内为加上不显色的大肠菌群数量和t值

(P>O.05)；大肠杆菌经验证总体符合率均为100％(表4，图1)。

表4 两种实际样品中的大肠杆菌在CCEA、Agar I和Agar II上培养基培养结果

注：冰棍和冰淇淋样品中未发现有大肠杆菌。查表t(1)_0.05=12.7

本实验室试制的显色培养基CCEA优于经典方法VRBA，与国外同类产品Agar I和Agar II相比，检验效果差异无统计学意义。

讨 论

显色法可直接观察菌落颜色，可以把检测、计数和鉴定一次完成。这些基于酶的实验方法具有简便、快速、准确和检出率高的优点。从上述4种实际样品SN法与显色法比较检测所得到的菌落数和符合率数据可见，再次验证了显色法的优点。在用显色法检测上述实际样品时，在验证过程中，测试菌株阴沟肠杆菌产气慢，40～48 h才会产气，实际样品中出现一些可疑菌落在乳糖发酵管生长时超过24 h后才产气，但经鉴定为大肠菌群，如用国标MPN法时会判定为大肠菌群阴性，因此国标MPN法有存在漏检的情况。由于大肠杆菌O157不具有大多数大肠杆菌所具有的β-D-葡萄糖苷酶，因此其在CCEA、Agar I和AgarlI平板上生长时并无大肠杆菌的特性，不能与非大肠杆菌的大肠菌群区分，如要求检测大肠杆菌O157时，应选用其他的培养基。

作者：卢勉飞 吴清平 蔡芷荷  何天文

参 考文 献

[1]马绪荣，苏德模主编．药品微生物学检验手册．北京：科学出版社．2000：467-468．

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[3]张军民，周贵民．临床细菌检验快速方法应用进展．中华医学检验杂志，1998，21：325—327．

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[5]中华人民共和国国家标准．GB／T 4789．3-2003食品卫生微生物学检验大肠菌群测定．

[6]中华人民共和国进出口商品检验行业标准．SN 0169-92．出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法．

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