GB 14963—2011
附录A
嗜渗酵母计数
A.1 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
A.1.1 恒温培养箱：25℃±1 ℃。
A.1.2 冰箱：2℃～5 ℃。
A.1.3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。
A.1.4 天平： 感量0.1g。
A.1.5 无菌试管：18mm×180 mm。
A.1.6 无菌吸管：1mL（具 0.01mL 刻度），10 mL（具 0.1mL 刻度），或微量移液器及吸头。
A.1.7 无菌锥形瓶：500mL，250mL。
A.1.8 无菌培养皿：直径 90mm。
A.1.9 无菌 L 型涂布棒：玻璃、塑料或者不锈钢材料制成，棒体直径不应大于 2 mm。
A.1.10 显微镜： 10×～100×。
A.2 培养基和试剂
A.2.1 30％葡萄糖溶液（pH 6.5±0.5）
A.2.1.1 成分
无水葡萄糖 30.0g
蒸馏水 100mL
A.2.1.2 制法
称量适量葡萄糖，溶解在蒸馏水中，必要时调节 pH 为 6.4左右。分装后，115℃高压灭菌 20min。
A.2.2 氯硝胺 18%甘油（ DG18）琼脂
A.2.2.1 成分
酪蛋白胨 5.0g
无水葡萄糖 10.0 g
磷酸二氢钾 1.0g
硫酸镁（MgSO4·H2O） 0.5g
氯硝胺 0.002g
无水甘油 200g
琼脂 15g
氯霉素 0.1g
蒸馏水 1000mL
A.2.2.2 制法
除氯霉素外，将全部成分加热煮沸至完全溶解，如有必要，调节 pH 为 6.4左右。加入抗菌素，121 ℃高压灭菌 15 min，最终的 pH 应为 5.6±0.2。灭菌后，立即在 44 ℃～47℃水浴冷却至 50 ℃以下，在每个灭菌平皿中倾注大约 15 mL～20mL 培养基，放置在水平的台面上冷却固化备用。如有必要，可以放在 36℃培养箱中过夜，使琼脂表面干燥无水珠。避光保存。
A.3 检验程序
A.4 操作步骤
A.4.1样品采集和保存
样品采集后，应尽可能及时检验。若不能及时检验，普通样品应置 2℃～5℃冰箱保存，在 24h 内检验。冷冻样品应在 45℃以下不超过 15min 或在 2 ℃～5 ℃不超过 18 h解冻。
A.4.2 样品稀释
A.4.2.1 取样
以无菌操作在天平上称取固体或液体检样 25 g，加入 30％葡萄糖稀释液 225g，用旋转刀片式均质器以 8000 r/min 均质 1min，或拍击式均质器拍击 2 min，制备成 1:10 的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入加有玻璃珠的无菌锥形瓶中，并充分振荡。
A.4.2.2 梯度稀释
用灭菌吸管吸取 1:10 稀释液 1mL，注入含有 9mL 30％葡萄糖稀释液的试管内，置于漩涡混悬仪上混匀，制备 1:100的稀释液。另取 1mL 灭菌吸管，按前操作依次制备 10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1 支 1 mL 灭菌吸管。
A.4.3 涂布和培养
A.4.3.1 根据对检样污染情况的估计，选择 2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种 2个 DG18 琼脂平板。在充分混合稀释液之后，立即在每个平板表面接种 0.1mL，接着用无菌的 L 型涂布棒进行充分的琼脂表面涂布。注意涂布棒下端不得触碰培养皿的侧缘。进行样品检验的同时，应同时在2 个 DG18 琼脂平板表面接种 0.1mL 的稀释液作为空白对照。
A.4.3.2 接种完成后，尽快将全部平板置 25 ℃±1 ℃恒温箱内避光培养。培养时勿翻转培养皿。为防止出现霉菌的过度蔓延生长掩盖了目标菌落，在培养 48 h后，即开始每日观察平板上面真菌生长情况。培养 7 d结束。
A.4.4 菌落计数
A.4.4.1 选择菌落数量在 15～150之间的平板，计数菌落数量。
A.4.4.2 典型的嗜渗酵母在 DG18 琼脂平板上呈现为圆形、中心隆起、不透明、边缘整齐的菌落，直径 1 mm～2 mm。必要时，可利用低倍显微镜直接观察平板上生长的菌落是否为细菌菌落。如出现霉菌菌落干扰时，不应计数丝状菌落。
A.4.5 报告
参照GB 4789.2的报告方式，以 CFU／g 为单位报告样品中嗜渗酵母的数量。
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