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食源沙门菌DNA环介导恒温核酸扩增法检测



录入时间:2011-10-14 9:34:40 来源:互联网

 

  沙门菌是食源性致病菌中一个主要的属,在各类细菌性食物中毒事件中,沙门菌造成的食物中毒位居前列〔12〕。常规的沙门菌检测方法费时费力,已经不能满足食品生产质量控制的要求〔3〕。因此,需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法。Notomi等开发出一种新的恒温核酸扩增法—环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification of DNALAMP)45〕。本研究利用DNA环介导恒温核酸扩增法对市售不同生肉来源的沙门菌进行快速检测,并且着重在灵敏度和特异性方面对此方法进行验证,以建立的LAMP反应条件能够对今后病原微生物的检测研究工作提供参考依据。

 

    1  材料与方法

 

    1.1  菌株  猪霍乱沙门菌猪霍乱亚种ATCC13312(S.ATCC13312)(广东省微生物研究所);其余5株沙门菌HB009HB371HB069HB215HB143分别分离自市售的生猪肉、海产品、生牛肉、生羊肉和鸡肉。其他属菌株共14株保藏于本实验室,作为沙门菌环介导恒温核酸扩增反应特异性试验中的对照菌株。所有菌株均保存在质脂双层(LB)培养基中。

 

    1.2  仪器及试剂  HtPot40恒温金属浴(合肥艾本森科学仪器有限公司)PCR扩增仪ABI2700(美国ABI公司);凝胶成像系统(BIO-RAD Gel Doc EQ凝胶成像系统)Bst大片段DNA聚合酶(爱尔兰Biolabs公司);甜菜碱(分析纯,美国Sigma公司);琼脂糖以及引物合成(大连TaKaRa生物公司)

 

    1.3  方法

 

    1.3.1  LAMP反应引物设计  以沙门菌的属特异性基因invA67〕为靶基因,选择位于8 091331之间的DNA序列作为LAMP扩增区域。将待扩增的DNA分为6个独立的区域,根据这6个区域分别设计LAMP反应所需2对引物(内引物FIPBIP、外引物F3B3)FIPF2F1C两部分组成,BIPB2B1C两部分组成,其2个部分都能分别识别靶DNA正义链和反义链独立区域。外引物F3B3分别识别靶DNAF2B2的外侧的独立区域,F3序列是5-gcaacagctacgtgatga-3′;B3序列是5-ctctattgccggcatcatta-3′。2对引物识别靶DNA6个独立区域。FIP22个碱基F1C20个碱基F2,以及中间连接的TTTT组成,序列是5-cttagatccccgcattgttggttttccgccacatattatcgcgat-3′;BIP21个碱基B1C20个碱基B2,以及中间连接的TTTT组成,序列是5-gaccatcatgaatggtcagcattttattggcggtatttcggtcta-3(引物由大连宝生物公司合成)

 

    1.3.2  LAMP反应  (1)DNA模板制备:DNA提取参照文献〔8〕。(2)LAMP反应体系:25μl反应混合物包括各1.6 μmolLFIPBIP,各0.2 molLF3B31×恒温缓冲液,1 molL的甜菜碱,6 mmolLMgSO41.6 mmolLdNTP8 U/μl的大片断DNA聚合酶,1 μlDNA(3)反应过程:除了大片断DNA聚合酶,将其余的试剂混合物于95℃反应5 min,使DNA变性。然后迅速于冰上冷却,并加入Bst聚合酶,将反应物混匀,置于65℃恒温金属浴中反应60 min,最后在80℃条件下反应5 min结束反应。(4)LAMP产物检测:肉眼观察反应物的外观变化并在2%琼脂糖凝胶上100 V电泳分离25 min,加样量7 μl/上样孔。凝胶置于EB中染色10 min,水洗10 min,在BIO-RAD Gel Doc EQ凝胶成像系统下照像检测。

 

 

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