食源沙门菌DNA环介导恒温核酸扩增法检测

  沙门菌是食源性致病菌中一个主要的属，在各类细菌性食物中毒事件中，沙门菌造成的食物中毒位居前列〔1，2〕。常规的沙门菌检测方法费时费力，已经不能满足食品生产质量控制的要求〔3〕。因此，需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法。Notomi等开发出一种新的恒温核酸扩增法—环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)〔4，5〕。本研究利用DNA环介导恒温核酸扩增法对市售不同生肉来源的沙门菌进行快速检测，并且着重在灵敏度和特异性方面对此方法进行验证，以建立的LAMP反应条件能够对今后病原微生物的检测研究工作提供参考依据。

    1  材料与方法

    1.1  菌株  猪霍乱沙门菌猪霍乱亚种ATCC13312(S.ATCC13312)(广东省微生物研究所)；其余5株沙门菌HB009，HB371，HB069，HB215，HB143分别分离自市售的生猪肉、海产品、生牛肉、生羊肉和鸡肉。其他属菌株共14株保藏于本实验室，作为沙门菌环介导恒温核酸扩增反应特异性试验中的对照菌株。所有菌株均保存在质脂双层(LB)培养基中。

    1.2  仪器及试剂  HtPot40恒温金属浴(合肥艾本森科学仪器有限公司)；PCR扩增仪ABI2700(美国ABI公司)；凝胶成像系统(BIO-RAD Gel Doc EQ凝胶成像系统)。Bst大片段DNA聚合酶(爱尔兰Biolabs公司)；甜菜碱(分析纯，美国Sigma公司)；琼脂糖以及引物合成(大连TaKaRa生物公司)。

    1.3  方法

    1.3.1  LAMP反应引物设计  以沙门菌的属特异性基因invA〔6，7〕为靶基因，选择位于8 091～331之间的DNA序列作为LAMP扩增区域。将待扩增的DNA分为6个独立的区域，根据这6个区域分别设计LAMP反应所需2对引物(内引物FIP和BIP、外引物F3和B3)。FIP由F2和F1C两部分组成，BIP由B2和B1C两部分组成，其2个部分都能分别识别靶DNA正义链和反义链独立区域。外引物F3和B3分别识别靶DNA上F2和B2的外侧的独立区域，F3序列是5′-gcaacagctacgtgatga-3′；B3序列是5′-ctctattgccggcatcatta-3′。2对引物识别靶DNA上6个独立区域。FIP由22个碱基F1C和20个碱基F2，以及中间连接的TTTT组成，序列是5′-cttagatccccgcattgttggttttccgccacatattatcgcgat-3′；BIP由21个碱基B1C和20个碱基B2，以及中间连接的TTTT组成，序列是5′-gaccatcatgaatggtcagcattttattggcggtatttcggtcta-3′(引物由大连宝生物公司合成)。

    1.3.2  LAMP反应  (1)DNA模板制备：DNA提取参照文献〔8〕。(2)LAMP反应体系：25μl反应混合物包括各1.6 μmol／L的FIP和BIP，各0.2 mol／L的F3和B3，1×恒温缓冲液，1 mol／L的甜菜碱，6 mmol／L的MgSO4，1.6 mmol／L的dNTP，8 U／μl的大片断DNA聚合酶，1 μlDNA。(3)反应过程：除了大片断DNA聚合酶，将其余的试剂混合物于95℃反应5 min，使DNA变性。然后迅速于冰上冷却，并加入Bst聚合酶，将反应物混匀，置于65℃恒温金属浴中反应60 min，最后在80℃条件下反应5 min结束反应。(4)LAMP产物检测：肉眼观察反应物的外观变化并在2％琼脂糖凝胶上100 V电泳分离25 min，加样量7 μl/上样孔。凝胶置于EB中染色10 min，水洗10 min，在BIO-RAD Gel Doc EQ凝胶成像系统下照像检测。

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