确诊布氏杆菌病的免疫学方法

1．试管凝集试验

    采集临床血清，预先稀释，取每份预先稀释好的4个不同稀释度的受检血清分别加入4个凝集试验管内，每管o．5ml，加0．5ml 20倍稀释的抗原于受检血清各试管内，并振摇均匀：置3；一40℃温箱24h，取出检查并记录结果。牛、马、鹿和骆驼1：100血清稀释度，锗、山羊、绵羊和狗1：50血清稀释度出现“++”以上凝集现象时，受检血清判定为阳性；牛、马、鹿、骆驼1；50血清稀释度，猪、山羊、绵羊、狗1：25血清稀释度出现“++”以上凝集现象时．受检血清判定为可疑反应。经3-4周后重检，如果仍为可疑，该牛、羊判为阳性：猪和马经重检仍保持可疑水平，而牲畜没有临床症状和大批阳性患畜出现，该畜被判为阴性；猪血清偶有非特异性反应，须结合流行病学调查判定，必要时应配合补体结合试验和鉴别诊断。排除耶尔森菌交叉凝集反应。

    2．补体结合试验(CFT)

    补体结合试验操作复杂，需有良好的实验设施和训练有素的人员作准确地滴定和保存试剂，尽管如此，该试验仍在广泛使用，而且还是公认的确诊方法。指示系统是2．5％一3％的已用等体积兔抗绵羊红细胞的血清(溶血素)致敏过的新鲜或以前保存的绵羊红细胞悬液(SRBCs)。试验前血清要灭活，可使用96孔U形板进行具体操作。

    第1排一第3排每孔加25rtl稀释的被检灭活血清，第2排为每份血清的抗补体对照。第一排各孔不加抗原，加入CFT缓冲液(抗补体对照)。除第2排外其他各排每孔加25ul CFT缓冲液。从第3排取稀释血清25rtl向后连续作系列倍比稀释。

    除第1排外每孔加入25uL稀释至工作浓度的抗原和稀释至含所需单位的补体。

    对照孔设置  只有稀释液，阳性血清+补体+稀释液，抗原+补体十稀释液和补体十稀释液。每一种对照总体积都设定为75uL。每一次试验中都设有能发生最小阳性反应的血清对照，用以检测试验条件的敏感性。

    微量板于37℃孵育30rain或4℃过夜，每孔加25ltl或50rtl致敏sRBC悬液，微量板于37℃再孵育30rain。

    微量板在4℃条件下1000g离心10min或4℃放置2～3h，使未溶解的红细胞下沉，溶血程度与相当于0、25％、50％、75％和100％溶血标准进行对比，判读结果。第1排检测每份血清的抗补体活性缺失情况。

    结果解释  当滴定结果等于或大于20个国际补体结合单位(1CFUT)时结合补体呈阳性，血清判为阳性。在3-6月龄时曾用牛种布氏杆菌19株免疫过的母畜，如果在其18月龄或更大时进行检测，其血清滴定等于或大于301CFTU／m1则判定其为阳性。

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