枯草芽孢杆菌的高效转化方法

高渗透法 

1、准备

40ml（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 10g/l，3.6g山梨醇pH=7.2。

200ml电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖）：18g 山梨醇，18.5g甘露醇，20g葡萄糖。

10ml RM（0.5M山梨醇，0.38M甘露醇）：0.9g山梨醇，0.7g甘露醇。

2个50ml离心管，灭菌。

2、转化

1）接种B.subtilis于3mlLB培养基中，过夜培养.。

2）取2.6ml过夜培养物接入40ml（LB+0.5M 山梨醇）中，37℃，200rpm培养至OD600=0.85~0.95。

3）将菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4℃离心收集菌体。

4）用50ml预冷的电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖），重新吹悬菌体，5000g，5min，4℃离心去上清，如此漂洗4次。

5）将洗涤后的菌体吹悬于1ml电转培养基中，每EP管分装120。

6）将60μl感受态细胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。电转仪设置：2.0kv，1mm,电击1次。（电击结果：时间常数=4.5~5.0ms，如果时间常数<4.2，则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数，来获得更高的转化效率）。

7）电击完毕取出杯子并立即加入1ml RM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。

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