一、目的
植物病毒的提纯是利用病毒粒子与寄主细胞各正常组分在理化特性上的差异，逐步将细胞成分尽可能去掉，同时保持病毒的活性。病毒提纯的程序和方法有多种多样。初步提纯主要包括破碎细胞和释放病毒、澄清提取液和浓缩病毒，得到粗提纯病毒制品。
本实验进行TMV和PVX的初步提纯，学习使用2万转高速冷冻离心机。
二、TMV的提纯
1.实验材料和用具
(1)．植物材料接种TMV三周以上的普通烟(Nicotianatabacum)
(2)．缓冲液0.2M和0.01M的磷酸钠缓冲液pH7.0
(3)．化学试剂巯基乙醇(2-ME)、正丁醇、聚乙二醇(PEG6000)、氯化钠。
(4)．玻璃器皿量筒、烧杯、三角瓶、漏斗、滴管、吸管。
(5)．仪器变速组织捣碎机、2万转高速离心机、磁力搅拌器、恒温水浴。
2.TMV提纯程序一
(1)．在组织捣碎机中匀浆系统显症叶片加2倍含有1％巯基乙醇的0.2M磷酸盐缓冲
液(W/V)，3-5分钟。
(2)．双层尼龙纱过滤，得初提汁液。
(3)．在磁力搅拌器上边搅拌边加入8％正丁醇(V/V)，在叶绿素凝聚后，继续搅拌
15分钟。
(4)．离心，10000g4℃20分钟，留上清液
(5)．搅拌中，依次加入4 ％的氯化钠和4 ％聚乙二醇(W/V)，4℃下搅拌1-1.5小时
(6)．离心，10000g，4℃20分钟，留沉淀
(7)．0.01M磷酸盐缓冲液再悬浮沉淀(按初提纯汁液2/10加缓冲液，V/V)，4℃搅拌
1小时。
(8)．离心，10000g，4℃15分钟，留上清液
(9)．重复(5)
(10)．离心，10000g4℃20分钟，留沉淀
(11)．0.01M磷酸盐缓冲液再悬浮(按初提纯0.5-1/10加入，V/V)
(12)．离心，10000g20分钟，留上清液，应为乳白色病毒悬浮液，4℃保存。
3.TMV提纯程序二
(1)．TMV病叶，加等量缓冲液(W/V)(0.2MPBpH7.0，4℃)
(2)．匀浆3-5分钟，尼龙纱过滤
(3)．汁液在60℃加热10分钟(水浴)
(4)．5000g离心4℃5分钟，弃沉淀
(5)．上清液依次加4 ％NaCl ，4 ％聚乙二醇(分子量6000)边加边搅拌，4℃下搅拌4
小时或过夜
(6)．5000g离心4℃20分钟，弃上清液
(7)．沉淀加初汁液0.5-1/10(V/V)量的0.01MPBpH7.04℃悬浮1-3小时。
(8)．10000g离心4℃10分钟，弃沉淀
(9)．上清液为TMV病毒初提纯液
三.PVX提纯
1.实验材料和用具
(1)．植物材料接种PVX三周以上的普通烟和曼陀罗(Daturastramonium).
(2)．缓冲液0.5M磷酸钾缓冲液+1M尿素，pH7.4
(3)．化学试剂巯基乙醇(2-ME) 、铜试剂(NaDIECA) 、氯仿(CHCL3 ) 、聚乙二醇(PEG6000)、氯化钠、曲拉通(TritonX-100)
(4)．玻璃器皿烧杯、量筒、三角瓶、吸管、滴管
(5)．仪器同前
2.提纯程序
(1) ．在组织捣碎机中匀浆系统显症叶片，缓冲液(1 ∶2W/V) 中加0.01M铜试剂和
0.5％巯基乙醇，匀浆3-5分钟。
(2)．加冷却氯仿(1 ∶1W/V)，变速研磨1分钟。
(3)．离心，8200g，4℃15分钟，留上层水相，得初提液。
(4)．加4 ％聚乙二醇和0.25M氯化钠，搅拌1小时。
(5)．离心，10000g4℃30分钟，留沉淀。
(6)．用缓冲液再悬浮沉淀，加1％TritonX-100缓冲液用量为：10ml/100ml初提液，
搅拌2小时。
(7)．离心，3000g4℃10分钟，留上清液。
(8)．重复(4)
(9)．离心，10000g4℃30分钟，留沉淀。
(10)．再悬浮，缓冲液用量为1ml/100ml初提液。
(11)．离心，3000g4℃10分钟，留上清液，即为病毒悬浮液，4℃保存。
注意：(1)．如不能连续完成程序，可延长PEG沉降或再悬浮时间；
(2)．最后再悬浮时缓冲液用量尽可能少些；
(3)．条件可能时，尽量在4℃下操作。
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