植物病毒的二次提纯

一. 目的

    不同浓度和稳定性的病毒可用各种方法及步骤作进一步提纯。操作过程中应注意对提纯病毒的产量、侵染力和粒子完整性（长条病毒）的影响。
    本实验应用蔗糖密度梯度离心对实验四中所得的粗提产品作进一步提纯，学习了解各步骤操作方法和超速离心机的使用。

二、操作步骤

  1．制备蔗糖梯度柱用BECKMAN离心机SW28型转头的离心管制备33ml的梯度柱。
  2．加样2-3ml。
  3．超速离心，25,000转，4℃2小时。
  4．取病毒带后加入2倍容量的缓冲液稀释。
  5．超速离心，30号转头，45,000转，4℃1.5小时。保留沉淀。
  6．每管0.5—1ml缓冲液再悬浮，即为病毒提纯产品。
  7 ．用双光束双波长分光光度计分别作粗提纯和精提纯悬液320—220nm光谱吸收图，比较二者的吸收峰和A260/280值的差别。

  注意：①．上样前的粗提悬液应保证一定的浓度，才能在密度梯度离心中形成病毒带。②．使用不同型号转头时加样量不同，并应换算离心力和转速。③．最后的超速离心沉淀应为无色半透明。

三、蔗糖梯度柱的手工制备

  根据所用的转头和离心管决定梯度柱的容量。
  ①．用0.01M ，pH7.0 磷酸缓冲液分别配制10 ％、20 ％、30 ％和40 ％的蔗糖液(W/W)。
  ②．以BECKMANSW28转头的离心管按7ml(10％)、7ml(20％)、8ml(30％)和8ml(40％) 的比例由低浓度开始加入管中。用10ml注射器和长针头将蔗糖液依次注入离心管底部，最后加3ml50％(W：W)的蔗糖垫，形成由上至下，浓度由低到高的梯度柱，放置12—15小时后使用。
  操作时注意不要摇动离心管；注入蔗糖液时动作要慢；放置时间不可过长或过短。

四、上样

    不同大小的梯度管上样量不同，SW28型转头的梯度离心管加样2-3ml 。加样时用注射器从管壁与液面成45—46o角倾斜缓缓加入，针头高出液面2—3mm，也可用吸管或滴管加样。

五、取样

  1、如有可见带，可用注射器和端部弯成直角的注射针头取出。
  2 、如无可见带，由液面开始用微量取样器顺序取样，每管1ml分别测定A260和A280值，选A260/A280 比值最接近标准者合并并作超速离心。

上一篇：植物病毒的初提纯

下一篇：植物病毒血清学检测—免疫双扩散反应