植物病毒血清学检测—免疫双扩散反应

     免疫双向扩散反应是在半固态基质(琼脂胶)中的沉淀反应，具有简便和直接应用血清的优点，并可由沉淀线的形成特点分析病毒间的关系。但受病毒粒子形态的影响，使用有局限性，更适用于球形病毒，同时也有灵敏度不高的缺点。

   1.实验材料和用具

    (1)抗血清
    (2)系统感染病毒的植株和健康植株。
    (3)生理盐水、0.025M磷酸缓冲液(PB)，pH7.2 ，3 ％SDS(十二烷基硫酸钠)、10％NaN3(叠氮钠)、精制琼脂粉(或琼脂糖粉)。 

    (4)塑料培养皿、打孔器、滴管、吸管、微量离心管、量筒、三角瓶、50℃热水浴。 
 

    2.实验步骤  

    (1)取1g琼脂粉(依琼脂质量可在0.5-1.5g之间)加入100ml   PB煮至琼脂完全融化(对光看，无颗粒状物)，加1ml 10％NaN3，加蒸馏水补足至100ml，放在热水浴中待用。

    (2)将融化的琼脂倒入塑料或玻璃培养皿约2mm 厚(8.8cm直径的培养皿中约放20ml) ，室温下放置30分钟使凝固。倒琼脂液时注意保持液面水平，凝固前避免移动。
    (3)制备病毒样品，如为球形病毒，1g叶组织加1ml缓冲液研磨；如为长条病毒，1g叶组织加1ml缓冲液再加1ml   3％SDS研磨。将汁液放入微量离心管中3000转离心2分钟备用，根据需要，半提纯样品液也可作为样品。
    (4)用生理盐水稀释抗血清为三个浓度1 ∶2，1 ∶4，1 ∶16。
    (5)用打孔器在凝固的琼脂板上打孔，可有各种大小及排列形式，常用为2-5mm直径和梅花状排列,用镊子,针头或抽吸器去掉孔中凝胶。
    (6)加样时可因实验的目的不同而有不同的组合方式，常用的为中心孔加抗血清,周围孔加抗原及健株对照,加样量以满面而不溢出为度。
    (7)25℃下保存孵育24-48小时，观察沉淀线的形成，记录结果。

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