植物病毒血清学检测—对流免疫电泳

    对流免疫电泳也称为免疫电渗电泳，抗原在碱性缓冲液(大于等电点pH8.2 以上)中带负电，在电场中向正极移动；而抗体球蛋白接近于等电点，借电渗液流的作用与抗原的迁移方向相反，缓慢移向阴极。故通过适当安排抗原和抗体孔的位置，在短期内(30-60分钟)抗原和抗体可以相遇，结果在两孔间形成沉淀线。

    1. 实验材料和用具

    (1)抗血清
    (2)纯化病毒或病汁液
    (3)0.05M巴比妥缓冲液,pH8.6，10％NaN3，1.5％SDS，琼脂糖(电泳用)。

    (4)载玻片、打孔器、微量加样器、饭盒、电泳仪和水平电泳槽、4℃冰箱。 

    2. 实验步骤 

    (1)洗净载玻片，泡在乙醇中，使用前取出擦干备用。
    (2)用缓冲液配制1％琼脂糖凝胶，煮化后加入0.02％NaN3，80℃水浴中备用。

    (3)在微量离心管中将等量的1.5％SDS和提纯病毒混匀，开水浴中煮2-4分钟备用。
    (4)用吸管吸取2ml琼脂糖凝胶，加在载玻片上，注意保持液面水平，分布均匀，厚度为2mm，室温下放置15分钟，移入冰箱10分钟使其充分凝固。
    (5)在凝胶上打孔，根据样品数量打两排孔，孔径3mm，孔距3mm，排距5mm，分别标记为阳极和阴极。
    (6)去掉孔内凝胶，抗原和待测样品(可以作适当稀释)包括阳性和正常对照样品加在阴极侧一排孔中，注意不要溢出(1mm厚的凝胶加10μl)；在另一排孔中加入抗体(可用PBS稀释)。
    (7)将玻片放入水平电泳槽，用纱布或滤纸连好电桥，抗原孔端联负极,抗体孔端联正极。以0.05M 巴比妥pH8.6为电泳缓冲液，电流量为4V/cm片，电泳30-60分钟，待沉淀线可见为止。

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