植物病毒血清学检测—酶联免疫吸附技术(ELISA):间接ELISA

二.实验材料和用具

    1.专化性抗体免疫球蛋白IgG(浓度约为1mg/ml)

    2.系统感染病毒的植株和健康植株

    3.酶标记羊抗兔抗体球蛋白IgG(市售)

    4.40孔或96孔酶联板
    5.酶联免疫检测仪。台式离心机。冰箱。
    6.微量取液器(40－200 μl可调，1000ul可调，20ul可调）；洗瓶。
    7.包被缓冲液；洗涤缓冲液；IgG稀释缓冲液；底物溶液；邻苯二胺(OPD）；过氧化氢（H2O2 ）；2M硫酸。

    8.10ml、200ml量筒；5ml 、10ml、100ml、500ml烧杯；50ml三角瓶；100ml、500ml容量瓶；研钵；记号笔；小塑料袋；2-5ml可调洗涤瓶。

三. 配制缓冲液

    (1)抗原包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)
   Na2C031.59g；NaHCO32.93g；NaN30.2g，蒸馏水加至1升。

    (2).洗涤缓冲液(0.02MPBS-吐温缓冲液，PBS-T，pH7.4)
   NaCl8.0g ；Na2HPO4 '12H2O2.93g；KH2PO4 0.2g； 
   KCl0.2g；NaN30.2g；蒸馏水加至1升后加Tween-200.5ml.

    (3).IgG稀释缓冲液(0.02MPBS-T，牛血清白蛋白溶液)

    取0.1g牛血清白蛋白溶于用灭菌蒸馏水配制的PBS-T缓冲液100ml中即成。

    (4).底物溶液(邻苯二胺溶液)pH5.0

    柠檬酸2.55g;Na2HPO4 ，12H2O9.2g加蒸馏水500ml 
    称取40mg邻苯二胺(OPD)，溶解后过滤，加上述缓冲液至100ml，临用前加30％H2O20.15ml即成(注意邻苯二胺也需新鲜配制). 
        

四.实验步骤

    1.包被抗原：取显症叶片和健康叶片用抗原包被缓冲液分别配制1∶10，1 ∶100，1 ∶1000样品悬浮液，过滤或3000rpm低速离心后备用。
    2.按设计(可以参考附图设计)在酶联板上加样，每孔200 μl，加盖后4℃冰箱过夜(或25℃温箱孵育3-5小时或37℃孵育2小时)。
    3.用IgG稀释缓冲液配制特异性抗体IgG稀释液100μg/ml，10μg/ml，2 μg/ml，4℃保存备用。
    4.洗涤：倒尽酶联板上的抗原溶液,用洗涤缓冲液冲洗三次,每次3分钟。
    5.加抗体：按设计加入特异性抗体IgG,每孔150μl,25℃温箱孵育2-5小时。
    6.洗涤三次，同前。
    7.用IgG稀释缓冲液配制酶标羊抗兔IgG(工作浓度按说明书)。
    8.加酶标羊抗兔IgG,每孔100μl,室温或25℃温箱中孵育2-5小时。
    9.洗涤三次，同前。
    10.底物：加底物溶液，每孔150μl，室温20－30分钟。
    11.终止：每孔加一滴2M硫酸终止反应。
    12.目测以颜色深浅记录+++，++，+，±，-。
    13.用酶联仪(波长492毫微米)记录O.D值，比阴性对照读数高二倍以上者一般判断为阳性。
    注意：必须设置空白对照、健康对照和阳性对照；每个样品应2-3次重复；反应结束应立即用酶联检测仪读数，否则读数不准确。