植物病毒血清学检测—酶联免疫吸附技术(ELISA):(Fab')-ELISA

二.实验材料和用具

   1.专化性抗体免疫球蛋白IgG(浓度约为1mg/ml)

   2.系统感染病毒的植株和健康植株

   3.酶标记羊抗兔抗体球蛋白IgG(市售)或A蛋白标记的碱性磷酸酯酶(Sigma产品)。

   4.酶联板、微量加样器、洗瓶、酶联读数仪

   5.抗原包被缓冲液、洗涤缓冲液、IgG稀释缓冲液、底物溶液

三.实验步骤

   1.配制缓冲液
    (1).抗原包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)
    Na2C031.59g；NaHCO32.93g；NaN30.2g蒸馏水加至1升。

    (2).洗涤缓冲液(0.02MPBS-吐温缓冲液，PBS-T，pH7.4)
    NaCl8.0g ；Na2HPO4 '12H2O2.9g；KH2PO4 0.2g； 
    KCl0.2g；NaN30.2g；蒸馏水加至1升后加Tween-200.5ml.

    (3).IgG稀释缓冲液(0.02MPBS-T，牛血清白蛋白溶液)
    取0.1g牛血清白蛋白溶于用灭菌蒸馏水配制的PBS-T缓冲液100ml中即成。
    (4).底物溶液(邻苯二胺溶液)
    a液：柠檬酸19.2克加水溶至1000ml为0.1M柠檬酸溶液
    b液：Na2HPO4.12H2O71.6g加水溶至1000ml为0.2MNa2HPO4溶液。 
    取a液24.3ml加b液25.7ml混合即成磷酸盐-柠檬酸缓冲液pH5.0 。
    称取40mg 邻苯二胺，溶解后过滤，加上述缓冲液至100ml ，临用前加30 ％H2O2 0.15ml即成(注意邻苯二胺也需新鲜配制)。

    (5).碱性磷酸脂酶底物缓冲液：
二乙醇胺缓冲液：二乙醇胺97ml，蒸馏水800ml，混合，用浓HCl调pH=9.8 ，加水至1000ml。取硝基酚磷酸pNPP60mg溶于100ml上述二乙醇胺缓冲液中，即为底物缓冲液(现配现用，时间长了会变色)。
    碱性磷酸脂酶标记的A蛋白(Sigma产品)，溶于1.0ml50%甘油中即可使用。 
    2.取显症叶片和健康叶片用抗原包被缓冲液分别配制1 ∶10，1 ∶100，1 ∶1000 样品悬浮液，过滤或低速离心后备用。
    3.按设计(同实验三)在酶联板上加样，每孔200 μl，(Fab')2 以1/2000-4000的比例稀释在50mM包被缓冲液(pH9.6)中；在30℃下孵育四小时，或4℃过夜(时间长，包被好)；
    4.洗板三次同实验三；
    5.样品稀释在提取缓冲液中，4℃下孵育过夜；洗板同前；
    6.IgG(可用未纯化的抗血清) 以1/2000-4000的比例稀释在提取缓冲液中，30℃孵育三小时，洗板同前；
    7.酶标A蛋白以1/2500比例稀释在提取缓冲液中，30℃孵育三小时，洗板同前；
    8.加底物，室温孵育不超过30分钟(过氧化物酶)，2-4小时(碱性磷酸酯酶)，用酶联免疫检测仪测定结果。