直接提取病毒侵染病株总RNA

一. 目的

     在植物病毒研究中,有时很难或不必要先提纯病毒后再分离病毒RNA，而是直接将病叶中包括病毒RNA在内的植物总RNA大分子分离出来，获得的总RNA可用于RT- PCR 、点杂交、northern杂交和分离植物抗病基因差异表达的cDNA 的方法（DDRT- PCR ）。本实验学习用酚-SDS-LiCl法提取病毒RNA。

二.实验材料

     TMV、CMV或其它病毒等侵染的新鲜或冰冻叶片。

三.实验用仪器及药剂

     高速离心机，真空干燥仪，微量取样器，1.5mL离心管
     抽取缓冲液(20mMTris-HClpH8.0；1%SDS；200mMNaCl；5mMEDTA)
     饱和苯酚/氯仿(1  ∶1)，氯仿/异戊醇(24  ∶1)，4MLiCl，70%的乙醇，DEPC处理后灭菌蒸馏水。

四.实验步骤

  1.取适量病毒侵染病叶于研钵内，加液氮，将材料研磨成极细粉末，取300-500mg粉末放入1.5mL离心管中，
  2.加入加300-500 μl抽提缓冲液
  3.加等体积饱和苯酚/氯仿(400 μl)，轻微振荡混合2-5分钟
  4.12000rpm离心5分钟
  5.取上清水相，再加等体积饱和苯酚/氯仿，混合抽提
  6.12000rpm离心2分钟
  7.加等体积氯仿/异戊醇(24  ∶1)抽提一次
  8.取上清水相，加等体积冷4MLiCl，混匀、置4℃下3小时以上
  9.12000rpm离心15分钟 
  10.倒去上清,沉淀用70%冷乙醇(0.5ml)洗涤3次 
  11.真空干燥,3～5分钟 
  12.沉淀溶于20 μl灭菌重蒸馏水中,-20℃保存

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