直接提取病毒侵染病株中dsRNA

一. 目的

植物ssRNA病毒在在植物体内增殖中，通过核酸互补而形成一种碱基配对的dsRNA，还有一些病毒核酸是dsRNA 。这类双链核酸在健康植物体内一般是不存在的。因此，检测dsRNA的存在可以达到诊断病毒侵染的目的，并根据不同病毒的dsRNA 电泳图谱的差异来区分不同的病毒。该方法易行、快速、操作简单、不需要昂贵的仪器。分离出来dsRNA还可用于RT-PCR、核酸杂交和cDNA合成。

二 实验材料

     TMV、CMV或其它病毒等侵染的新鲜或冰冻叶片。

三.实验用仪器及药剂

     高速离心机，真空干燥仪，微量移液器，50mL和1.5mL离心管，磁力搅拌器

CF-11 纤维素（Whatman ），10XSTE缓冲液(0.5MTris-HClPh6.8 ，1MNaCl ，10mMEDTA) ， 10%SDS ， 纯 化 皂 土 ， 饱 和 苯 酚 ， 氯 仿/ 异 戊 醇 (24∶1) ， 3MNaAc(pH5.2)，100%和70%的乙醇，灭菌蒸馏水。

四.实验步骤

程序（一）：

  1.取适量病毒侵染病叶(5-7克)于研钵内，加液氮研磨成细粉末，倒入三角瓶中 
  2.融化后加入2倍的2XSTE抽提缓冲液（W/V ）、10%SDS至终浓度为1XSTE和2%的SDS，必要时加纯化皂土
  3.加等体积饱和苯酚，置摇床或磁力搅拌器上振荡混合30-60分钟
  4.8000rpm，离心20分钟
  5.取上清，加等体积氯仿，混合抽提10分钟（此步可略去）
  6.10000rpm，离心10分钟
  7.取上清水相，加无水乙醇至终浓度为15-18%，加2~3%（V/W ）的CF11，搅拌30分钟
  8.12000rpm，离心3-5分钟,弃上清
  9.沉淀加入1XSTE  （含16%乙醇），振荡1-5分钟 
  10.12000rpm，离心3-5分钟,弃上清 
  11.重复9.10步骤2-3次 
  12.沉淀加入5mL1XSTE,振荡悬浮1分钟 
  13.12000rpm，离心3-5分钟,取上清 
  14.重复12.13步骤1次，合并上清 
  15.加1/10体积3MNaAc，2.5倍体积冷无水乙醇，混匀、置-20℃下2小时以上 
  16.12000rpm，离心15分钟，沉淀用70%乙醇洗两次 
  17.真空干燥,3～5分钟 
  18.沉淀溶于适量灭菌重蒸馏水或STE中,-20℃保存

程序（二）：

  7.取上清水相，加无水乙醇至终浓度为15-18%，

  8.称取2.5gCF11，加入30Ml1XSTE/16%乙醇，制备纤维素柱
  9.将样品液加在柱子顶部过柱 
  10.用1XSTE  （含16%乙醇）100-120mL充分洗柱 
  11.用5mL1XSTE洗脱第1次，弃掉洗脱液 
  12.用5mL1XSTE洗脱第2次，收集洗脱液 
  13.再用5mL1XSTE洗脱第3次，收集洗脱液 
  14.合并后两次收集的洗脱液
  其余步骤同程序（一）。

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