海博微信公众号
海博天猫旗舰店
海博微信公众号
海博天猫旗舰店
一. 目的
DNA.RNA 的分离，纯化及鉴定用的凝胶电泳有两类，一类是琼脂糖凝胶电泳,适用于0.2kb和小于30kb的核酸分离；另一类是聚丙烯酰胺凝胶电泳，适用于小于1kb的核酸分离。
核酸研究中琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速分离、纯化和鉴定DNA和RNA的方法，通过本实验掌握植物病毒RNA的电泳分离技术，了解电泳中凝胶浓度、核酸分子大小及构象、电泳缓冲液和电压与分离效果的密切关系。
二.实验材料
各种提纯病毒RNA、病叶总RNA或dsRNA。
三.实验用仪器及药剂
稳压稳流电源;水平电泳槽;核酸紫外灯或凝胶成像分析仪;
电泳缓冲液：Tris-硼酸(5 ×TBE)液：Tris108g ，EDTA9.3g（配成0.5MPH8.0 的母液），硼酸55g，溶于1000ml.pH8.2，长期保存，用时稀释。
凝胶加样缓冲液(10 ×):0.25%溴酚兰(BPB),40%(W/V)蔗糖水溶液，4℃保存。
溴化乙锭(EB)染色液:10mg/ml溶于水
四.实验步骤
(一)琼脂糖凝胶制备
1.1%浓度琼脂糖胶:据凝胶板大小计算凝胶液总量，称取琼脂糖粉，溶于0.5 × TBE电泳缓冲液中
2.置沸水浴或微波炉中加热至沸腾，至少2次，以使琼脂糖充分溶解
3.冷却至55-60℃左右加入溴化乙锭(EB)，浓度为0.5ug/ml，充分混匀
4.在胶床开口的两端用胶布或胶纸封好，确保倒胶不漏，置水平台面上
5.梳子固定在小凹槽内,，梳子平面与胶床底面垂直，梳齿前端和胶床底面留有0.5～1mm间隙
6.将凝胶倒入胶床中，床高3～5mm，30分钟～1小时后胶凝固，撕掉胶布
7.将胶床置于电泳槽中，加入1×电泳缓冲液，缓冲液的量以超出凝胶表面1～2mm为宜，小心地拔出样品梳子，样品孔自然充满缓冲液，如样品孔内有残留气泡应除去
(二)上样与电泳
1.RNA样品中加入0.1-0.2倍体积10X凝胶加样缓冲液，混匀后用微量移液器吸取样品点入样品孔中，同时加已知分子量的参照样品。
2. 电泳时靠加样孔的一头接负极（黑色），打开电源开关，电压调至所需伏数(小于5V/cm)，当染料颜色移至适宜位置处足够分离目的核酸时(0.5-2小时左右)停止。
3. 电泳完毕，将电泳仪电压调回到零位后关电源，从胶床上取下凝胶置紫外检测仪上(波长254nm)或在凝胶成像分析仪上进行观察、分析，并记录结果。
照相:在相机上加红色滤色镜光圈放到4～5.6,用21NID胶卷,速度约在0.5～2分钟间。
4.分析病毒核酸组分并根据照片测算核酸分子量，以及核酸质量和浓度。
注意:EB有诱变作用及中性毒性，操作时应带手套或充分注意。RNA 电泳所用试剂应专用，防止RNA酶降解。
上一篇：直接提取病毒侵染病株中dsRNA
下一篇：紫外分光光度法测定提纯病毒的浓度
