紫外分光光度法测定提纯病毒的浓度

一、目的

     由核蛋白组成的病毒有特有的紫外吸收峰，通过紫外分光光度计使用，掌握其测定原理、操作方法及病毒纯度与定量的方法。

二、主要仪器、用具及药剂

    紫外分光光度计、石英比色皿、移液管、吸管、试管、缓冲液、镜头纸。

三、实验材料

    TMV或CMV等病毒提纯样品悬浮液。

四、实验步骤

   １．准备好提纯品及参比溶液，倒入石英比色杯。
   ２．打开稳压电源及751分光光度计，将比色杯装入样品槽。
   ３．按附录操作程序使用紫外光测量样品在波长260nm及280nm处的光吸收值(以A或OD值表示)记录数值。
   ４．每种病毒的蛋白与核酸含量有固定比例( 附表) ，用本次试验吸收光谱比值(A260/A280)与标准比值比较。

   ５．用A260值计算病毒的浓度及产量。
  病毒浓度(mg/ml)=A260X稀释倍数／E0.1%1cm260nm，

    E为消光系数，即在波长260nm时，浓度为0 ·1％(1mg/ml)的悬浮液，光程为1cm时的光(光密度)吸收值。对已知病毒可以从附表中查到；对未知病毒要想定量病毒，先把病毒纯品干燥称重，配成已知浓度的病毒悬液，在260nm下测其光密度，并折算成E0.1% 1cm。

    病毒产量(mg/kg)＝浓度X提纯总ml数X1000/组织重(g)
[注意：测量时所用测量杯的宽度应是1cm，若杯宽为0.5cm，则所得光密度值应乘以2] 。由于光散射的影响，所测定的光密度大于病毒实际上的吸收光密度，因而存在误差。因此，准确测定常常对测定的光密度进行校正(见附录)。

附表：几种植物病毒的消光系数(E值)和A260/A280值

     病毒种类                          E0.1%1cm260nm       A260/A280

                (TMV)              3  1                1  19
     烟草花叶病毒                         ·                   ·
                (CMV)              5  0                1 65
     黄瓜花叶病毒                         ·                   ·
                   (TYMV)          9  6                1 51
     芜青黄色花叶病毒                       ·                   ·
          Y    (PVY)               2  8                1 28
     马铃薯 病毒                         ·                   ·
          X    (PVX)               2  97               1  19
     马铃薯 病毒                         ·                   ·
                (TNV)              5  6                1 70
     烟草坏死病毒                         ·                   ·
                (TRV)              3  0                1 88
     烟草脆裂病毒                         ·                   ·
                (TEV)              2  4                1 27
     烟草蚀纹病毒                         ·                   ·
                (TRSV)             12 8
     烟草环斑病毒                          ·
          S    (PVS)               3  0
     马铃薯 病毒                         ·

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