植物病毒抗血清的制备

一.目的

    制备植物病毒抗血清是用提纯病毒作为抗原，注射兔子后刺激产生免疫反应，形成抗体的过程。分为抗原准备、免疫注射和抗血清的采集三部分。本实验介绍常用方法，要求能基本掌握并获得抗血清。

二.实验材料和用具

   １.提纯病毒悬浮液、３公斤公兔、高压灭菌锅、磁力搅拌器；
   ２.医用羊毛脂、石蜡油、70％乙醇、二甲苯、NaN3、凡士林。 

   ３.用具：注射器、注射针头、小烧杯、三角瓶、透析袋、刀片、脱脂棉、青霉素小瓶、转子。

三.操作程序和方法

   １.处理提纯病毒悬浮液：如用精提纯病毒，浓度为1mg/ml，如保存病毒时所用缓冲液浓度高或含有其他高渗透压物质如尿素等，则可用pH7.2 的0.01M磷酸缓冲液透析三次（其中－次必须过夜），如病毒悬浮液中加过NaN3，则必须延长透析时间和增加次数。
   ２.制备Freund's不完全佐剂：在小烧杯中放入1.5g羊毛脂和8ml石蜡油，在温水浴中化开，磁力搅拌器上混匀后经高压灭菌后4℃下保存备用。
   ３.将佐剂倒入小烧杯中，在磁力搅拌下按1：1量逐滴加入病毒悬浮液，充分搅拌至乳化完全，病毒液1mg/ml含量每次用2-5mg 。(将病毒悬浮液和佐剂在小烧杯中１：１等量混合，用注射器和针头反复推吸以使乳化完全也可)。检测乳化程度时可滴一滴乳化液至水面，如很快散开则乳化不完全，须继续乳化；如能持续片刻不散开则为乳化完全。
   ４.兔子以个大(2-3公斤)、健康、未经免疫的白兔为好，选用公兔或未交配过的母兔均可。
   ５.免疫：根据不同病毒的稳定性和免疫原性，可有多种注射方法与不同间隔的方案，本实验采用肌肉注射。
    在兔子后腿外或内侧肌肉上选肥厚处，剪毛后，用70 ％乙醇消毒、以9号针头注入病毒-佐剂乳化液，进针约深2cm。注射剂量视其具体情况而定。本实验免疫具体设计
如下：
    第一周：(1).耳静脉取血，制备少量正常血清；
    (2).肌肉注射乳化病毒2/3量，皮下三点注射1/3量。
    第二周：肌肉、皮下注射，用量如上。
    第三周：肌肉、皮下注射，用量如上。
    第六～七周：取血，测效价，效价最高时放血，制备抗血清。
   ６.采血：采血方法主要有静脉采血、颈动脉采血、心脏采血等。采血所用器具要
经严格消毒。采血前免疫兔要给水、停食12-24小时。本实验耳静脉采血，步骤如下：
     (1).将免疫兔装入固定箱中，使头和耳全部露出。人工固定亦可。
     (2).耳背外缘静脉处刮毛、用酒精将采血耳边缘里、外两面消毒。 

     (3).耳中部用蘸有二甲苯的脱脂棉涂擦，使耳血管充血，血流加速，其上涂一层凡士林。
     (4).在耳缘已扩张血管端部，用刀片尖顺血管方向纵向划破1-2毫米的切口(此后再采血时，切口位置自端部向耳基部移动)。适度时，血液随即流出，血液收集在灭菌小烧杯中，每次取血20-40ml。不要让血液接触酒精，以免发生溶血现象。
     (5).切口部位用干药棉压迫止血，并擦净兔耳上残留血迹，防止兔子抓挠造成流血或感染。
     (6).可连续多次采血，每次间隔3-4天。如效价下降，可再次注射适量抗原，以维持更长采血时间，采血期间，加强动物的营养。
   ７.血清的析出及保存。
     (1).将收集血液置室温下凝固后，盖好置37℃温箱1-2小时。
     (2).用解剖刀沿烧杯边缘轻轻剥离凝血块。
     (3).盖好置4℃冰箱过夜。
     (4).吸出析出血清，在3000rpm下离心10分钟。
     (5).上清液即为无红血球的澄清抗血清，按1/5000的量加入硫柳汞或1/1000量加入NaN3防腐。无菌分装后密封-20℃保存。

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