植物病毒的负染技术

一．目的 
    负染方法是在分子水平上阐明病毒质粒细微结构的一种常用方法，在电镜生物样品制备中以快速、简便、用量少和反差大效果好而成为一项普遍应用的重要方法。通过几种负染法的实验，初步掌握病毒病的快速诊断方法。

二．基本原理

    高密度重金属盐类染色剂对蛋白质不能染色，因此可在病毒粒子周围的背景处沉积下来，造成很强的电子散射而形成较暗的背景，病毒粒体易被电子束穿透成为亮的物体，如同照片的底片（负片）一样，这种染色方法被称为负染。

三．主要仪器、用具及药剂

仪器：电镜、超净工作台、温箱、冰箱、万分之一天平、酸度计、显微镜。
药剂：磷钨酸、醋酸双氧铀、戊二醛、冰乙酸、聚乙烯醇缩甲醛(Formvar)、氯仿（三氯甲烷）、无水乙醇、双蒸水。
用具：载玻片、工具盒,铜网、镊子、单面刀片、手术剪、滴管、Parafilm膜、蜡片、培养皿、滤纸,小烧杯，白瓷盘、滴瓶及蒸溜水、圆头玻棒、250 目铜网、平底皿、卡片纸、5ml量筒、玻璃条、铅笔。

三．实验材料

    提纯的烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)或其它提纯病毒，病毒侵染的病叶

四．实验步骤

    （一）.提纯病毒的负染色

  第一种方法：

1.将提纯的ＴＭＶ悬液用蒸馏水进行1：10或1：100的稀释；
2.用镊子夹持铜网，滴管吸取样品加在铜网上，稍待片刻，用滤纸片从铜网边缘吸掉余液；

3.待铜网上的液体将干未干时，立即滴一滴2-3 ％磷钨酸负染色液，注意不能使铜网背面粘上液体。1～2分钟后，用滤纸吸掉余液，自然干燥；
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4.将染好的铜网放在培养皿中，作好记录，37  C温箱中干燥0.5～1小时即可进行电镜观察。

第二种方法：

1.将提纯的CMV悬液与1％戊二醛固定液按10：1比例在蜡片上混合（戊二醛最终浓度为0.1％)，固定10～15分钟；
2.用镊子夹持铜网，沾取样品悬液，稍待片刻；
3.用滴管吸取双蒸水，连续洗滴铜网，洗掉戊二醛固定液等，清洗完毕后用滤纸吸掉余液。
4.待铜网上液体将干未干时，漂浮在1％醋酸铀或3 ％磷钨酸负染色液滴上，1～2分钟后取出铜网，用滤纸吸掉余液。 
5.将染好的铜网放在培养皿中，37 ℃温箱中干燥0.5～1小时即可。

   （二).植物病毒浸出法负染色

第一种方法：

1.在载玻片上滴一滴双蒸水或0 ·005M磷酸缓冲液；
2.将一小片植物病叶放置于液滴中并用刀片切碎，让病毒释放到液滴中；
3.夹持铜网，沾取浸出液，稍待片刻，用滤纸吸掉余液；
4.再如上述相同方法进行染色。

第二种方法：

1.将凹玻片中加几滴双蒸水或2 ％磷钨酸负染色液；
2.取一小片植物病组织剪碎并在液滴中充分研细；
3.吸液滴到载玻片；
4.用镊子夹持铜网倒扣到载片玻璃上，然后按上述相同方法进行染色。若浸出液中植物残渣过多，可先用双蒸水对铜网滴洗后再进行负染色。也可将组织浸出液经低速离心（2000～4000rpm)后，沾取上清液进行染色。）

第三种方法：
1.在取材前一天，将供试材料浇足水分。取材时选有代表性的病叶剪下，将几张病叶重叠到一起，一手捏紧，另一手持锋利刀片，将几张叶片同时割破，此时破口处将有汁液渗出。
2.用尖细镊子夹住带膜铜网，使膜面朝向破口处，轻轻沾取汁液至铜网上
3.待铜网汁液将干未干时，将吸取负染液的毛细管呈45o角插入镊子两臂的间隙中间，轻而慢地滴加负染液。使染液经过带膜铜网上而随即流逝。
4.待铜网上染液停留3～5分钟，吸去余液。
5.37℃温箱中干燥0.5～1小时后电镜观察。

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