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一．目的
掌握缺口平移(Nick--Translation)标记DNA探针的原理和方法,掌握同位素探针检测植物病毒的方法。
二.原理
核酸杂交是指两条来源不同的单链核酸依据碱基互补配对原理，在一定的温度和离子强度条件下会形成稳定的异质双链的过程。已知序列的核酸片段（可用放射形同位素或地高辛、生物素等非放射性标记物标记）称为探针，被检测的核酸称为目标核酸。常用的探针标记方法有缺口平移、随机引物、末端标记及RNA探针等。缺口平移的方法是基于低浓度的DNA酶Ⅰ在Mg2+存在的条件下，能在DNA链上随机产生游离的3 ′-OH末端缺口。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ能够催化一个核苷酸加到3 ′-OH端的缺口上。同时,DNA聚合酶Ⅰ的5 ′→3 ′的外切酶活性能够将核苷酸从缺口的5 ′-P末端 除去。一个新的带3 ′-OH的核苷酸被掺入原来被切去的核苷酸的位置上,这样切口就向3 ′方向移动了一个核苷酸。这种3 ′端移动使带标记的核苷酸能顺序地代替原先被除去的核苷酸而掺入到DNA 中,用此方法制备的探针被广泛地应用于各种杂交技术中。
三.材料及试剂
感病植株番杏，健康植株(作为阴性对照)，已知病毒或含有病毒基因的质粒阳性(作为阴性对照)。用于标记探针的模板(PCR产物、或回收的DNA片段)。
植 物 总 RNA 抽 提 缓 冲 液 ( 内 含1%SDS 、20mMTris-HCL 、200mMNaCl 、5mMEDTApH7.8),苯酚:氯仿:二异戊醇(25 ∶24 ∶1),Nick-TranslationKit(内含DNA酶Ι和DNA 聚合酶Ι的混合液,10 ×Nick-Translation 缓冲液、dNTP), α-P32-dATP 、20 × SSC(175.3g氯化钠,88.2g柠檬酸钠,蒸馏水定容至1000ml,pH7.0)、50 ×Denhardt’s试剂(5g聚蔗糖Ficol、5g聚乙烯吡咯烷酮PVP、5g牛血清白蛋白BSA,蒸馏水定容至500ml)。予杂交液( 内含5 ×SSC、5 ×Denhardt ′s试剂、0.1%SDS.50% 甲酰胺、100ug/ml鲑精DNA)。
尼龙膜，水浴摇床、封口机杂交炉和杂交瓶，X光片、卡式暗盒、保鲜膜或同位素感光板。
X光片显影液(3.5g米突尔、60g无水亚硫酸钠、9g几奴儿、40g无水碳酸钠、3.5g溴化钾于50℃溶解,蒸馏水定容至1000ml)。X光片定影液(120g硫代硫酸钠、7.5g无水亚硫酸钠、6.3ml冰乙酸、3.75g硼酸于30 C温水溶解,当水温低于30℃时加入7.5g硫酸铝钾,蒸馏水定容至500ml)。
四.步骤
1.样品的制备，参见RNA提取实验
2.点杂交
⑴．尼龙膜处理：将尼龙膜用ddH2O浸透后,放入5 ×SSC中浸5分钟。
⑵．点样：将尼龙膜从5 ×SSC中取出,放于滤纸上,分别点上样品,阴性对照和阳性对照各1-5μl （dsDNA样品需变性后点样）。可用狭槽装置（slothybridization）点样。
⑶．膜的干燥及固定：将膜在室温中晾干或用吹风机吹干后,放入80℃烘箱中烤两小时或120℃半小时。
⑷．予杂交：将固定好的膜放入ddH2O中浸润后,于5 ×SSC中浸5分钟，装入杂交袋或杂交瓶中，加入予杂交液3-5ml（杂交袋需赶完气泡后用封口机封口），42 ℃予杂交3小时以上。
⑸．探针的制备：0.5-2ug回收的探针模板DNA, 5 μldGTP、dCTP、dTTP混合物(浓度均为0.4mmoi/L), 0.5uldATP(0.4mmol/L), 5ul10 ×Nick-Translation buffer, 2.5 μl α-P -dATP, 加ddH2O至50 μl, 混匀,15℃保温1小时后, 加5 μl0.25MEDTA终止,100℃变性5分钟,使DNA变成单链探针,置于铅罐内,-20℃保存。
⑹．杂交：将经变性的DNA探针加入含有预杂交液的杂交袋(瓶)中,42℃杂交16小时以上。
⑺．洗膜：用1×SSC(含0.2%SDS)洗膜两次,每次各15分钟；用0.2×SSC(含0.2%SDS)洗膜2-3次,20-30分钟。每洗完一次膜用同位素检测器检测放射强度,洗至阴性对照处计数很弱,阳性对照处仍很强。
⑻．压片：将洗好的膜放在滤纸上稍干,吸去多余的水分,用保鲜膜将膜包好,固定在卡式暗盒的增感屏上,在黑暗中(可以在红光下)将X光片取出,压在膜上,盖好暗盒,并用胶布将口封住,将暗盒放入-20℃冰箱中过夜(陈旧同位素可稍长)。
（9）冲片：将X光片于红光下取出放入显影液中3-5分钟(以显出影相为准),将X光片放入水中漂洗一下,放入定影液中固定10分钟后即可取出。
注：也可用同位素感光板快速压片。
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