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一、目的
采用光敏生物素作光照标记则可以避免以上不足，本实验利用长臂光敏生物素标记，由于克服了空间位阻，使检测灵敏度成百倍地提高(其灵敏度已接近放射性同位素的水平)。
用长臂光敏生物素标记的核酸探针与固定在硝酸纤维膜(NC膜)上的样品核酸分子进行斑点杂交，洗净后用抗生物素-碱性磷酸酶复合物(AV-AP)作酶标，与底物BCIP+NBT显色反应，即可观察检测结果。本实验目的即采用这一方法标记病毒特异片段作为探针，以期在核酸分子水平上检测特定的病毒。
二.实验材料和用具
1.材料
作为模板用的病毒外壳蛋白基因DNA片段，待测大田样品，阳性株、病毒或质粒。
2.试剂
长臂光敏生物素核酸探针标记和检测试剂盒：购自华美生物制品公司(军事医学科学院放射医学研究所生产)
硝酸纤维素膜(NC膜)：Bio-rad公司产品，产品号162-0116
甲酰胺：Fluka公司产品
牛血清白蛋白(BSA)：北京红星生物化学制品厂产品
普通化学药品由国内各化学试剂厂生产
三.实验步骤
1.光敏生物素标记GFV-cDNA探针于暗室中，将制备的待标记病毒-cDNA(0.5-1.0ug/ul，无用Tris溶解)定量加入小离心管中，加入等体积至倍量的光敏生物素溶液(1 μl/ μl)，充分混匀。将小离心管插入冰浴盒中，开启光标记灯(250W汞灯)灯头距液面10cm，光照20-25min。光标完毕，反应液为红褐色，加dH2O至总体积为100 μl ，加入100 μl仲丁醇，振荡混匀，离心1min，小心吸去上层丁醇相，再如上重复加仲丁醇萃取一次，吸去仲丁醇。仲丁醇提取2次后，水相体积应减少至40 μl，水相呈淡红色。在此液中，加入5 μl3MNaAc充分混匀，加100 μl冷无水乙醇，置于-20℃过夜。4℃离心15min。弃上清，用冷80%乙醇洗一次。沉淀真空干燥。沉淀溶于少量ddH2O，配制成母液。-20℃保存，用时稀释。
2.核酸斑点杂交
样品的制备：参见前面关于病毒RNA、总RNA的提取。样品在斑点杂交前先经热变性处理。
膜的处理：NC膜用2XSSC溶液湿润均匀，放在滤纸上，37℃晾干。
点样：用Tip头吸取样液1-5 μl ，分多次点样于NC膜上一点，使斑点尽可能的小，同时NC膜上要作记号。
烘干：放于一铺有洁净滤纸的培养皿中，80℃烘烤2小时。
配备预杂交液和杂交液：(每cm2 膜用80 μl的量，以下为5 ×10cm2用4ml)。
3：用前煮沸10min变性，速置冰水中冷却，再加入。
预杂交：将杂交条放入小管中,加入预杂交液2ml,42℃摇动2-4h。
杂交：将杂交条换入另一小管中,加入杂交液2ml,42℃摇动20-24h。
洗涤：将膜取出，放入平皿中，用杂交洗涤液A ：2 ×SSC，加0.1%SDS洗三次，每次5min，室温加振荡。
将膜放于三角瓶中，用杂交洗涤液B ：0.1 ×SSC，加0.1%SDS65℃振荡洗三次，每次5min。轻轻吸干滤膜，放入另一皿中，准备显色。
4.显色
封闭：用2ml3%BSA封闭液(3gBSA溶于70mldH2O中，用浓HCl调pH至3.0，煮沸20min 后，冷至室温，用 10mMNaOH 调pH 至7.5 ，加入10ml 缓冲液： 1MTris- HClpH7.520mMMgCl2 ，0.05%(V/V)TritonX-100 ，5.8gNaCl 。加水至100ml)，42 ℃封闭2-4h 以上(封闭液在4℃保存可重复使用3次,5 ×10cm2膜使用4ml)。
酶联：将膜取出，放入2ml抗生物素蛋白AV与AP酶偶联复合体溶液中，室温避光保温15min ，轻轻振荡。AV-AP 液：缓冲液：100mMTris-ClpH7.5 ，1.0MNaCl ，2mMMgCl2，0.05%(V/V)TritonX-100。4ml缓冲液内加入AV-AP8-16U，适合5 ×10cm2膜的用量。AV-AP溶液在4℃保存可反复使用多次。
洗涤：用洗涤液A ，B 各洗三次，每次5min 。显色洗涤液A ：100mMTris-ClpH7.5,1.0MNaCl,2mMMgCl2 ，0.05%(V/V)TritonX-100 。显色洗涤液B:0.1mMTris-ClpH7.5，0.5MNaCl，0.5%Tween-20。
显色：将膜放入另一管子中，加入新配制的底物溶液2ml ，再加入BCIP(1)10 μl，NBT(2)10 μl，避光放置。显色数分钟至数小时。阳性结果为出现兰紫色斑点。本底未出现前即可倾出显色液终止。
底物溶液：100mMTris-ClpH9.5,100mMNaCl,5mMMgCl2 。(1)BCIP10mg溶于200 μl 甲酰胺中。(2)NBT15mg溶于200 μl70% 甲酰胺中。此二液均可在-20℃保存。
终止反应：用终止液(10mMTris-ClpH7.5，1.0mMEDTA)洗一次，dH2O冲洗净，封存于聚乙烯袋中，避光保存。选择膜湿润状态拍摄结果。
