植物病毒的Northernblot分析

一、目的
    Northernblot分析是将提取的样品RNA先通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离后，将RNA转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，然后在通过杂交分析RNA的数量和大小。比点杂交有更高的特异性。可用于病毒缺失突变体及转病毒基因植物转录水平分析。
    采用地高辛（digoxigenin ）标记标记探针，克服了同位素探针的不足，并且其检测灵敏度已接近放射性同位素的水平。Dig-11-dUTP是由类固醇半抗原dig与dUTPC11位结合形成，可用直接结合有荧光色素或酶的抗地高辛配基抗体或间接使用免疫荧光法进行检测。采用这一方法标记病毒特异片段作为探针，可以长期保存使用方便。

二.实验材料和用具

1.作为模板用的病毒基因片段，待检大田样品，已知病株或病毒。
2.试剂
    地高辛核酸探针标记和检测试剂盒：BoehringerMannheim 公司, 甲酰胺和甲醛,10XMOPSbuffer(200MmMOPS,50MmNaAc,10MmEDTA,Ph7.0),1.2%变性琼脂糖凝胶(100ml:1.2g,10mL10XMOPSbuffer,加水到74,加热溶解,冷至70后,加入16甲醛,混匀后迅速倒胶)。
    尼龙膜,电泳设备，杂交炉等。

三.实验步骤

1.地高辛标记病毒cDNA探针：按公司产品说明书进行。
2.样品RNA的分离
3.变性琼脂糖凝胶电泳：样品混合液（1XMOPS，50% 甲酰胺，6% 甲醛）上样、电泳。
4.转膜：尼龙膜用2XSSC溶液湿润均匀，利用10XSSC缓冲液毛细管吸引作用或真空转移法将RNA转到膜上。转膜后将膜侵入6XSSC5分钟，晾干置80℃烘烤2小时。
5.预杂交、杂交和洗膜同前述方法。

6.免疫检测：按公司产品说明书进行。

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