微生物在自然界中都是混杂地生活在一起，要想研究和利用某种微生物，须把它从混杂的微生物群中分离出来，以得到只含该种微生物的培养物。微生物学中，将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养（pure culture）。分离纯培养的方法通常有以下几种：
1．稀释法
（1）平皿倾注法
（2）平板涂布法 预先制备平板。然后制备并吸取适度稀释的菌液，滴于各平板中央（每皿一滴，约0.05ml），用无菌刮刀将菌液均匀涂布于平板表面。
2．平板划线法 划线的方式很多，其目的都是使平板上菌体逐渐变稀，最终形成单菌落。划线用平板也要预先制备。常用的是以下两种方式：
（1）针尖稍弯的接种针火焰灭菌并冷却后，取样；在靠近平皿边缘处的平板上，将针尖的弯曲部位接触平板，接种棒与平板面成30°～40°角，划3条～4条平行线；转动平皿约50°角，灼烧接种针，冷却后，通过前一区划2条～3条平行线，并继续划2条～3条不通过前一区的平行线；再转动平皿……如此划4区～5区（图3—5A）。此种方法适用于分离纯化固体培养基上的培养物。
（2）灼烧并冷却的接种环取样后，在平板上作连续划线（图3—5B）。此适用于液体样品。
3．单细胞挑取法 把一滴菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准某一个单独的细胞吸取，再接种于培养基上培养。此法限于高度专业化的科研。
4．利用选择培养基分离法
（1）采用选择性高的培养基 例如，以纤维素为唯一碳源，分离分解纤维素的微生物；用无氮培养基分离自生固氮菌；在15ml培养基中加25％乳酸1滴～2滴以抑制细菌生长，把受细菌污染的霉菌分离出来。
（2）培养基中加抑制剂 例如，结晶紫10mg/L可抑制G+细菌生长，利于分离G-细菌；KMnO4100mg/L抑制细菌和霉菌生长，利于分离放线菌；制霉菌素50mg/L或放线酮50mg/L利于分离纯化放线菌；分离纯化霉菌或放线菌时，加链霉素30mg/L、金霉素2mg/L可抑制细菌生长。
5．其他 如，高温处理（80℃ 15min或100℃ 10min）分离芽孢杆菌；4％KOH处理痰液，分离结核杆菌等等。
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