啤酒酵母的计数

一、实验目的：

    学习用血球计数板计数酵母数量的方法，

二、实验原理：

    啤酒发酵时，必须接入一定数量的酵母细胞；在发酵过程中，为了跟踪发酵的进程，判断发酵是否正常，也有必要测定悬浮酵母细胞的浓度。酵母菌的计数常用血球计数板方法。血球计数板是一块长方形的玻璃板，被四条凹槽分隔成三个部分，中间部分又被一横槽隔成上下两半，每一半上各刻有一个方格网，方格网的边长为3mm,分为9个正方形大格，每一大格为1mm²,其中中间那个大格被横向和纵向的双线分成25（或16）个中格，每个中格又被单线分成16（或25）个小格，因此一个大格中共有25×16=400个小格。这样的一个大格就是一个计数室。由于计数室比板表面要低0.1mm,因此盖上盖玻片后，整个计数室的容积就是0.1 mm³,相当于0.0001mL。

    计数时，先让计数室中充满待检溶液，然后计数400个小格中的细胞总数，就可换算出1mL发酵液中的总菌数。

三、实验器材：

    显微镜，血球计数板，盖玻片等。

四、实验步骤：

1. 取清洁的血球计数板一块，平放于桌面上，在计数室上方加盖专用盖玻片；

2. 取酵母菌液（发酵液）一小滴，滴至盖玻片的边缘，让菌液渗入计数室内，注意计数室内不能留有气泡。

3. 静置5分钟，让酵母细胞稳定附着于计数室内；

4. 将计数板置于显微镜的载物台上，先用低倍镜找到计数板的方格网，并移至视野中间（寻找时可通过缩小光圈，降低聚光镜，开低电源电压等方式减少进光量，使视野稍偏暗）；

5. 找到计数室位置（中间一个大方格），并看清由双线包围的中方格（16或25格）及由单线包围的小方格（共400格）；

6. 计数大格内的酵母细胞总数，必要时可在高倍镜下观察。

   若酵母细胞过多，可采取

（1）：稀释后再计数；

（2）：有代表性地选择左上，左下，右上，右下，中间五个中方格，计数其内的菌数，求得每个中格的平均值，然后乘以中方格数（25或16），即得每个大格内的细胞总数；

（3）：在上述5个中方格中选择处于顶角的4个小方格，计数，计算20个小方格中的总菌数，再乘以20，即得大格内的细胞总数。

7. 计算：

    酵母细胞数/mL=大格中的细胞总数×10000×稀释倍数

8. 血球计数板的清洗：

   将血球计数板立即用流水冲洗干净，若菌液变干，酵母细胞被固定在计数板上，则很难用流水冲洗干净，必须用优质脱脂棉湿润后轻轻擦洗，再用流水冲洗干净，凉干

五、注意事项：

1. 血球计数板的计数室内刻度非常精细，清洗时切勿用试管刷或其它粗糙物品擦拭。

2. 加样前，应先放好盖玻片，让菌液自然吸入。如果先加菌液，则由于盖玻片较轻，可能会浮在菌液上，这样，计数室内的容积就不再使0.0001mL了。因此，为了使结果更加准确，最好不要用普通的盖玻片来替代。

3. 计数时，为避免重复或遗漏，对压在方格线上的细胞，应遵循数上不数下，数左不数右的原则（即凡压在上部或左面线上的细胞，都应计数入内，凡压在下部或右面线上的菌体，都应忽略不计）。对出芽细胞，如果子细胞大于母细胞的一半，则应算作两个细胞。

六、思考题：

  计数时，发现计数板不干净，怎样快速地清洗计数板？

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