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霉菌的形态观察实验



录入时间:2011-11-23 13:49:45 来源:易生物

霉菌菌丝比较粗大(菌丝和孢子的直径达到3-10μm),通常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍,因而可用低倍、高倍镜观察。霉菌菌丝细胞容易收缩变形,孢子容易飞扬,在制备霉菌标本时,常用乳酸石炭酸溶液作为介质,具有不使细胞变形,可杀菌防腐,不易干燥,能保持较长时间等优点。

一、实验目的
1. 学习并掌握观察霉菌形态的基本方法;
2. 了解常见霉菌(根霉、毛霉、曲霉、青霉、红曲霉、白地霉)的基本形态特征。

二、实验材料
1. 菌种:根霉(Rhizopus sp.)、毛霉(Mucor sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、青霉(Penicillium sp.)、红曲霉(Monascus sp.)的平板培养物,白地霉(Geotrichum candidum)摇瓶培养液。
2. 培养基:土豆琼脂培养基(PDA)或察氏培养基。
3. 溶液或试剂:乳酸石炭酸棉蓝染色液。
4. 其他:无菌吸管,平皿,载玻片,盖玻片,解剖针,显微镜等。

三、实验原理
霉菌菌丝比较粗大(菌丝和孢子的直径达到3-10μm),通常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍,因而可用低倍、高倍镜观察。霉菌菌丝细胞容易收缩变形,孢子容易飞扬,在制备霉菌标本时,常用乳酸石炭酸溶液作为介质,具有不使细胞变形,可杀菌防腐,不易干燥,能保持较长时间等优点。若加入棉蓝,又具有一定的染色效果。
霉菌的有些结构在制片过程中易被破坏,影响观察,可采用载片培养法。此法便于直接在显微镜下观察,尤其适用于根霉的假根、曲霉的足细胞及分生孢子链等结构的着生和生长情况的观察。并且还可以在同一标本上观察到微生物发育的不同阶段的形态。

四、操作步骤
(一)一般观察法:
1. 点种培养:用接种针沾取斜面少许孢子在无菌的察氏培养基中央穿刺接种(倒置培养皿穿刺接种),30℃下培养7-10天,形成巨大菌落培养物。
2. 直接制片:在载玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液于洁净,打开霉菌平板培养物,用解剖针从菌落的边缘挑取少量带有孢子的菌丝,放入载玻片的染液中,细心地把菌丝挑散开,加盖玻片,注意不要产生气泡,置于显微镜下观察,菌丝呈兰色,颜色的深度随菌龄的增加而减弱。
观察根霉时,注意观察其菌丝有无横隔、假根、孢子囊柄、孢子囊、囊轴、囊托、孢子囊孢子及厚垣孢子。
观察毛霉时,注意观察其菌丝无横隔、孢子囊柄、囊轴、孢子囊孢子及后垣孢子。
观察曲霉时,注意观察其菌丝有横隔、足细胞、分生孢子梗、顶囊、小梗(形状、层数及着生情况)、分生孢子。
观察青霉时,注意观察其菌丝有横隔、分生孢子梗、帚状枝(小梗的轮数及对称性)、分生孢子。
观察红曲霉时,注意观察其菌丝有横隔、分生孢子着生情况、闭囊壳、子囊孢子。
(二)载玻片湿室培养观察法
也称载片培养法,用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上,接种后盖上盖玻片培养,霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后,将载玻片上的培养物置于显微镜下观察。载片培养法制备的标本片可直接在显微镜下观察,这种培养观察方法保持了霉菌的自然生长状态,尤其适用于根霉的假根、匍匐菌丝,曲霉的足细胞的观察,并且还可在同一标本片上观察霉菌的不同生长阶段的形态。
载玻片湿室培养观察法具体操作:
1. 准备湿室:在培养皿底部铺一张圆形滤纸片,滤纸片上依次放上“U”形载玻片搁架、载玻片、盖玻片(两片),盖上皿盖,外用纸包扎,高压灭菌(9.8×104Pa)20分钟后,60℃烘箱干燥,备用。
2. 取菌接种:用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子,置于湿室的载玻片上,每张载玻片可接同一菌种的孢子两处。接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可。
(接种量要少,以免培养后菌丝过于稠密而影响观察)
3. 加培养基:用无菌细口滴管吸取少许融化并冷却至45℃的培养基,滴加到载玻片的接种处,培养基应滴得圆而薄,直径约为0.5cm(滴加量一般以1/2小滴为宜),注意无菌操作。
4. 加盖玻片:在培养基未彻底凝固前,用无菌镊子将皿内的盖玻片盖在琼脂薄层上,用镊子轻压盖玻片,使盖玻片和载玻片之间的距离相当接近,但不能压扁。
(盖玻片不能紧贴载玻片,要彼此留有小缝隙,一是为了通气,二是使各部分结构平行排列,易于观察。)
5. 倒保湿剂:每皿倒入约3mL 20%的无菌甘油,使皿内滤纸完全湿润,以保持皿内湿度,盖上皿盖。制成载玻片湿室,28℃培养。
观察:将培养好的载玻片取出,置于显微镜下直接观察。

 

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