霉菌的形态观察实验

霉菌菌丝比较粗大（菌丝和孢子的直径达到3-10μm），通常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因而可用低倍、高倍镜观察。霉菌菌丝细胞容易收缩变形，孢子容易飞扬，在制备霉菌标本时，常用乳酸石炭酸溶液作为介质，具有不使细胞变形，可杀菌防腐，不易干燥，能保持较长时间等优点。

一、实验目的
1. 学习并掌握观察霉菌形态的基本方法；
2. 了解常见霉菌（根霉、毛霉、曲霉、青霉、红曲霉、白地霉）的基本形态特征。

二、实验材料
1. 菌种：根霉（Rhizopus sp.）、毛霉（Mucor sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）、青霉（Penicillium sp.）、红曲霉（Monascus sp.）的平板培养物，白地霉（Geotrichum candidum）摇瓶培养液。
2. 培养基：土豆琼脂培养基（PDA）或察氏培养基。
3. 溶液或试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液。
4. 其他：无菌吸管，平皿，载玻片，盖玻片，解剖针，显微镜等。

三、实验原理
霉菌菌丝比较粗大（菌丝和孢子的直径达到3-10μm），通常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因而可用低倍、高倍镜观察。霉菌菌丝细胞容易收缩变形，孢子容易飞扬，在制备霉菌标本时，常用乳酸石炭酸溶液作为介质，具有不使细胞变形，可杀菌防腐，不易干燥，能保持较长时间等优点。若加入棉蓝，又具有一定的染色效果。
霉菌的有些结构在制片过程中易被破坏，影响观察，可采用载片培养法。此法便于直接在显微镜下观察，尤其适用于根霉的假根、曲霉的足细胞及分生孢子链等结构的着生和生长情况的观察。并且还可以在同一标本上观察到微生物发育的不同阶段的形态。

四、操作步骤
（一）一般观察法：
1. 点种培养：用接种针沾取斜面少许孢子在无菌的察氏培养基中央穿刺接种（倒置培养皿穿刺接种），30℃下培养7-10天，形成巨大菌落培养物。
2. 直接制片：在载玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液于洁净，打开霉菌平板培养物，用解剖针从菌落的边缘挑取少量带有孢子的菌丝，放入载玻片的染液中，细心地把菌丝挑散开，加盖玻片，注意不要产生气泡，置于显微镜下观察，菌丝呈兰色，颜色的深度随菌龄的增加而减弱。
观察根霉时，注意观察其菌丝有无横隔、假根、孢子囊柄、孢子囊、囊轴、囊托、孢子囊孢子及厚垣孢子。
观察毛霉时，注意观察其菌丝无横隔、孢子囊柄、囊轴、孢子囊孢子及后垣孢子。
观察曲霉时，注意观察其菌丝有横隔、足细胞、分生孢子梗、顶囊、小梗（形状、层数及着生情况）、分生孢子。
观察青霉时，注意观察其菌丝有横隔、分生孢子梗、帚状枝（小梗的轮数及对称性）、分生孢子。
观察红曲霉时，注意观察其菌丝有横隔、分生孢子着生情况、闭囊壳、子囊孢子。
（二）载玻片湿室培养观察法
也称载片培养法，用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置于显微镜下观察。载片培养法制备的标本片可直接在显微镜下观察，这种培养观察方法保持了霉菌的自然生长状态，尤其适用于根霉的假根、匍匐菌丝，曲霉的足细胞的观察，并且还可在同一标本片上观察霉菌的不同生长阶段的形态。
载玻片湿室培养观察法具体操作：
1. 准备湿室：在培养皿底部铺一张圆形滤纸片，滤纸片上依次放上“U”形载玻片搁架、载玻片、盖玻片（两片），盖上皿盖，外用纸包扎，高压灭菌（9.8×104Pa）20分钟后，60℃烘箱干燥，备用。
2. 取菌接种：用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子，置于湿室的载玻片上，每张载玻片可接同一菌种的孢子两处。接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可。
（接种量要少，以免培养后菌丝过于稠密而影响观察）
3. 加培养基：用无菌细口滴管吸取少许融化并冷却至45℃的培养基，滴加到载玻片的接种处，培养基应滴得圆而薄，直径约为0.5cm（滴加量一般以1/2小滴为宜），注意无菌操作。
4. 加盖玻片：在培养基未彻底凝固前，用无菌镊子将皿内的盖玻片盖在琼脂薄层上，用镊子轻压盖玻片，使盖玻片和载玻片之间的距离相当接近，但不能压扁。
（盖玻片不能紧贴载玻片，要彼此留有小缝隙，一是为了通气，二是使各部分结构平行排列，易于观察。）
5. 倒保湿剂：每皿倒入约3mL 20%的无菌甘油，使皿内滤纸完全湿润，以保持皿内湿度，盖上皿盖。制成载玻片湿室，28℃培养。
观察：将培养好的载玻片取出，置于显微镜下直接观察。

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