肉毒毒素检出及肉毒梭菌检验

A、肉毒毒素的检出

　　肉毒中毒的诊断，重要的是毒素的检出及定型；罐头食品的细菌学检验，有时需要证实肉毒梭菌的存在，不过，最终还是要根据产毒试验来鉴定细菌及其型别。

B、肉毒毒素检测的主要程序

1.初步的定性试验----小白鼠腹腔注射法

　　检验样品经适当处理后取上清夜，用明胶磷酸缓冲液稀释（1：5、1：10、1：100三个稀释度）后各取0.5毫升腹腔注射小白鼠；另取上清夜100℃10分钟加热后注射小白鼠；另取上清夜经胰酶处理后注射小白鼠；每个注射样注射二只小白鼠；注射后，定时观察小白鼠，连续观测48小时；排除24小时后死亡的白鼠和无症状死亡的小白鼠；48小时后，如果除了经热处理后再注射样品的小白鼠未死亡，其余小白鼠均死亡的情况，重复试验，增加稀释倍数，计算最底致死量。并进行抗毒素中和试验。

2.中和试验

　　用无菌生理盐水溶解冻干的抗毒素，，取A、B、E、F四种抗毒素注射于小白鼠体内；同时取未注射抗毒素的小白鼠做对照；注射抗毒素30分钟或1小时后，注射不同稀释度（覆盖10、100、1000倍最小致死量）的含毒素样品，观察48小时，如发现毒素未被中和，再取C、D型抗毒素和A-F多价抗毒素重复上述试验；如小白鼠死亡，应将含毒素样品稀释后再重复以上试验。

3．试验的几个注意事项

3.1典型的肉毒中毒，小白鼠会在4至6小时内死亡，而且98-99%的小白鼠会在12小时内死亡，因此，试验前24小时内的观察是非常重要的。

3.2 24小时后的死亡是可疑的，除非有典型的症状出现。

3.3如果小白鼠注射经1：2或1：5倍数稀释的样品后死亡，但注射更高稀释度的样品后未死亡，这也是非常可疑的现象，一般为非特异性死亡。

3.4小白鼠要用不会抹去的颜料加以标记。

3.5小白鼠的饲料与水必须及时添加、充分供应。

4.结果分析

4.1食物中发现毒素，表明未经充分的加热处理，可能引起肉毒中毒。

4.2检出肉毒梭菌，但未检出肉毒毒素，不能证明此食物会引起肉毒中毒。

4.3肉毒中毒的诊断必须以检出食物中的肉毒毒素为准。

4.4中和试验可以为毒素定型。

C、肉毒梭菌的检验与分离鉴定

　　肉毒梭菌检验方法的重点乃是产毒及毒素的检出试验，如要证实是否有肉毒梭菌存在，只要分离、培养、毒素鉴定即可。

1.前增菌

　　样品分别接种于疱肉培养基、TPGYT培养基，并分别与35、26℃培养7天。

2.分离

　　培养7天后，染色、镜检，观察菌的形态是否为典型的肉毒梭菌。取1-2毫升培养物加等量的酒精混合（或80℃加热10分钟，）后在室问温下培养1小时，非蛋白分解型的肉毒梭菌，因其芽胞不耐热，不要采取热处理的方法。

　　用接种环涂划酒精处理液或热处理的培养物于小牛肝卵黄琼脂或厌氧卵黄琼脂平板上，厌氧培养48小时，35℃。

　　典型菌落是隆起或扁平，光滑或粗糙，在卵黄培养基上用斜光检验时菌落表面通常出现虹晕色（iridescence）,此光区称为“珍珠层”，C、D、E型菌通常有2-4毫米黄色沉淀区围绕，A、B型菌通常显示较小的沉淀区。

　　挑取10个典型菌落，分别接种于疱肉培养基、TPGYT培养基，并分别与35、26℃培养7天，再取培养物按照1.2.1、1.2.2的方法进行肉毒毒素的检测即可。

　　生化反应试验，可以为鉴定做参考，以上肉毒梭菌的培养、分离、鉴定试验力求迅速，不要长时间接触空气，最好在厌氧条件下操作。

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