微生物发酵工程——提纯

二、提纯  

将所需要的产物从发酵液中分离出来的过程，也称后处理。主要包括细胞破碎，分离，醪液输送，过滤除杂，离子交换电渗析，逆渗透，超滤，凝胶过滤（层析），沉淀分离，溶媒萃取，蒸发，结晶，蒸馏，干燥包装等过程和单元操作。

1 、发酵液的固液分离

不管所需要的发酵产物是胞外代谢产物，还是胞内物质，甚至是菌体本身，首先都要进行固液分离，从发酵液中将细胞或其他固形物分开。其方法主要有预处理、过滤、离心和沉降。

预处理是通过改变发酵液的物理性质，增大固体颗粒粒度，尤其是降低粘度来絮凝蛋白质，去除高价无机离子及发酵液中的其它杂质的过程。如加入草酸盐去除 Ca 离子，加入三聚磷酸钠去除镁离子，加入黄血盐（形成沉淀）去除铁离子，加热或调节发酵液 pH 去除蛋白质等。凝聚和絮凝能有效聚集细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子。凝聚是在加入某些无机盐作用下，由于双电层排斥电位降低，使胶体形成不稳定状态的过程。絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在时，基于架桥作用使粒子形成较大的絮凝团的过程。

过滤是通过滤膜去除固体颗粒的过程。离心是在离心力的作用下，将悬浮液中的固相与液相加以分离的技术，多用于颗粒较细的悬浮液和乳浊液的分离。沉降常被用于初步分离和浓缩固体。这种方法简单低廉，但分离能力有限。发酵液中细胞所含水分可分为自由水、絮凝水、毛细水和胞内水等四种。一般沉降法去除自由水分，离心及过滤去除絮凝水分，毛细水分用高速离心机去除，而胞内水分只能藉助干燥去除。

为了保证离心和过滤的顺利进行，应严格控制发酵周期。周期太长，则菌体自溶，使发酵液粘稠，分离困难，有时甚至使发酵产物变性及破坏，因此对发酵液进行预处理是必要的。

2 、有效成分的提取

（ 1 ）、细胞破碎 要提取细胞内的酶、多糖和核酸等，必须首先破碎细胞。目前的基因工程产物，大都积累在细胞内，要获得这些产物，也必须先把细胞破碎。细胞破碎的方法很多，按是否存在外加作用力分为机械法和非机械法。机械法中的高压匀浆法在生产上应用较多，非机械方法如酶解法、化学渗透压法目前尚处在工业应用开发阶段．而其他非机械方法仅在实验室使用，工业应用仍受许多因素限制。

（ 2 ）、浓缩和沉淀 浓缩是将低浓度溶液除去一定量溶剂（包括水）变为高浓度溶液的过程，常见的有蒸发浓缩、冷冻浓缩和吸收浓缩等三种。浓缩常是发酵液提纯前的预处理过程。沉淀是工业发酵中最常用和最简单的一种提取方法。利用某些发酵制品能和一些酸、碱或盐类形成不溶性物质从发酵滤液或浓缩液中沉淀下来或结晶析出的一类提炼方法。同类分子或离子以有规律形式析出的过程称为结晶，而无规则紊乱的形式析出的过程称为沉淀。目前该法广泛应用于氨基酸、酶制剂及抗生素的提取。

（ 3 ）、离子交换及吸附 许多生物物质是两性物质，如四环类抗生素、氨基酸、蛋白质、多糖、核苷酸等。随着溶液 pH 值的不同，可以以阳离子、阴离子和偶极离子三种形式存在。这些分子能依靠静电力可逆地结合在离子交换树脂上。离子交换树脂是具有酸性或碱性功能的高分子化合物，因而能交换阴、阳离子。而大多数有活性的发酵产物都具有酸性或碱性功能团，在溶液中能与离子状态存在，并能与树脂的活性功能团交换。离子交换法广泛用于抗生素、氨基酸、有机酸、磷脂、长链脂肪酸以及核苷酸等极性带电小分子的分离提取，尤其在抗生素和氨基酸的生产中应用最广泛。近来离子交换也逐渐应用于蛋白质、核酸等大分子的分离提取，但所用分离介质大多是多糖类，主要应用的是层析原理，与离子交换有所不同。

在发酵工业中吸附主要用于酶、蛋白质、核苷酸、抗生素、氨基酸等产物的分离、空气的净化和除菌、脱色、去除热源等杂质。因此吸附可有两个目的，其一是将发酵产品吸附并浓缩于吸附剂上，其二是用吸附剂去除发酵液中的杂质或有害物质。

（ 4 ）、蒸馏 是分离液体混合物的一种有效方法，是基于发酵产物的沸点不同，将所需物质从液体混合物中分离出来的过程。它与蒸发不同，蒸发是去除低沸点物质和部分水蒸汽，使代谢产物保留浓缩的过程；而蒸馏要得到的恰恰是低沸点物质如酒精、白酒、丙酮、丁醇等。

（ 5 ）、萃取 将某种特定溶剂，加到发酵液混合物中，根据发酵液组分在水相和有机相中的溶解度不同，将所需物质分离出来的过程。此法常用于抗生素的分离工作中。如将抗生素发酵液与某一有机溶剂混合，并调节至适当的 pH ，大部分抗生素即溶于有机相中。有机相分离出来后，再调节 pH ，可使抗生素转至水相中，如此反复可得到较纯的抗生素。红曲发酵液中红色素的提取也可用此法。萃取法具有传质速度快、生产周期短、便于连续操作、可自动控制、分离效率高、生产能力大等优点，所以应用相当普遍。

近年来，由于技术的发展，萃取不一定在水相与有机相之间进行，发展出了双水相萃取法、反胶束萃取法和超临界流体萃取法等新技术。

（ 6 ）、层析 当发酵液浓缩物随流动相流经装有固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术，是 1960 年代才发展起来的快速、简便而高效的分离技术，应用非常广泛，如可用于脱盐、去除热源物质、浓缩高分子溶液、测定相对分子量、纯化抗生素等领域。其原理是基于被分离物质分子大小的不同，大分子物质不易进入凝胶颗粒（固定相）的微孔，因此向下流动的速度快；小分子物质除了可在凝胶颗粒间扩散外，还可进入凝胶的微孔中，因此向下流动的速度慢。

近年已发展出了气相色谱、中压液相色谱、高效液相色谱等新方法来分离样品。

（ 7 ）、膜分离 依靠特定的膜允许物质透过或被截留的过程。膜分离近似于筛分过程，依据滤膜孔径的大小而达到分离的目的。按分离粒子或分子大小的不同，分为透析、电渗析、微滤、超滤、反渗透和纳米过滤等六种过程。

3 、发酵产品的后加工

（ 1 ）结晶 是制备纯物质的一种有效方法。结晶过程因具有高度选择性，只有同类分子或离子才能形成结晶，所以析出的晶体很纯。在发酵工业中，结晶广泛用于抗生素、氨基酸、有机酸、糖、核苷酸、维生素、辅酶等小分子的生产。近来多糖、蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结晶也日益受到重视。生物小分子由于其结构比较简单，分离至一定纯度后，绝大部分都能定向聚合成分子型或离子型晶体。至于生物大分子，由于分子量大，结构复杂，不易定向聚集，因而结晶非常困难。

（ 2 ）干燥 生物产品含水易引起水解变性，影响质量，所以必须进行干燥处理。工业上干燥设备很多，但因生物制品大多为热敏性物质，易变性失活，所以用于生化产品的干燥必须快速高效，加热温度不能过高，产品与干燥介质的接触时间不能太长，而且为防止杂质混入和保持洁净干燥，干燥过程必须在密闭条件下进行。

发酵工业中，常用的干燥工艺有沸腾干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥及气流干燥。干燥工艺和设备的选择要与需要干燥的物料特点相匹配，一般来说，低温干燥的设备和运行费用要远远高于中温和较高温的干燥工艺。

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