细菌的芽孢染色

某些细菌在其发育的一定阶段可以形成一个内生孢子，即为芽孢。芽孢形成后并不脱离原细菌菌体，它的形状、大小和在菌体的位置都是一定的。老熟的芽孢可自菌体中脱落出来。芽孢结构上的特点是壁厚和细胞质浓厚，所以不易着色，通常多采用着色力强的染色剂和用加热等手段促使芽孢着色，并利用复染的方法对比原细菌菌体和芽孢，才易于在显微镜下看到它们。但是，若用简单染色法使菌体着色而芽孢无色也可以衬托出芽孢的形状、大小和位置。
【实验目的】
掌握细菌芽孢染色的方法。
【实验原理】
细菌的芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁较厚，对染料的透性差，不易着色，但是一旦着色又难以脱色。
通常，芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿在加热的条件下进行。染色完毕，用蒸馏水冲洗。因孔雀绿是弱碱性染料，与菌体结合力较差，因此易被水冲洗掉，而进入芽孢的孔雀绿却难于溶出。水洗后，再用一种呈红色的碱性染料复染，使菌体和芽孢呈现不同颜色。
【实验材料、药品及器具】
1、菌种 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）
2、染液 孔雀绿染液
藏花红染液
3、器皿 显微镜、酒精灯、镊子、洗净的载玻片4 片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、玻璃红、洗瓶装蒸馏水、接种环。
【实验步骤】
1、取培养24h左右的枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌分别涂片、干燥、固定。
2、在涂片部分用吸水纸条盖住，然后向纸条滴加孔雀绿液至饱和。
3、将涂片逐渐加热至微冒蒸汽并不时添加染液以防止吸水纸条干燥。染色
2-8 分钟。
4、除去吸水纸条，用蒸馏水轻轻冲洗掉多余染液。
5、用藏花红染液复染30~60S。
6、水洗，风干或烘干后镜检。
【实验结果】
1、首先用低倍镜，再用油浸镜检查制片，注意芽孢的颜色和菌体的颜色。
2、绘制芽孢图。注意芽孢在菌体内的位置、大小和形状并绘制游离芽孢形态图。
【思考题】
1、为什么经孔雀绿染色后，水洗再复染红色染液只能染上菌体？
2、用革兰氏染色能否看到芽孢，为什么？

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