分子生物学技术在微生物检验中的应用（1）

一、分子生物学技术在细菌分类中的应用

细菌的传统分类法和数值分类法以表型特征相似性为基础，而单纯表型相似性还不能准确地确定系统发育关系。随着分子生物学及遗传学的发展，细菌分类学中发展了一系列核酸分析方法，包括DNA分子中G＋C百分含量测定、DNA-DNA杂交、16S rRNA相关度分析等。

DNA分子中G＋C百分含量的测定

细菌DNA G+C或A+T摩尔百分比能反映细菌间DNA分子同源程度，不同种属间G+C mol%范围在25%~ 75%之间，但同一种细菌G+C mol%相当稳定，不受菌龄、培养条件和其他外界因素影响，亲缘关系越近的细菌，G+C mol%越相近，亲缘关系较远的细菌G＋Cmol%也不同，但G＋Cmol%相同或近似其亲缘关系不一定相近。最常用的测定方法是热变性温度法，其次是高效液相色谱法和浮力密度法。

DNA-DNA杂交

DNA杂交可得出DNA之间核苷酸顺序的互补程度，从而推断不同细菌基因组间的同源性。目前最常用的是复性速率法，变性DNA在溶液中复性（杂交）时，同源DNA的复性速率比异源DNA要快，同源性愈高，复性速率愈快。复性的过程也伴随着260nm紫外吸收的减少，再通过分光光度计直接测定变性DNA在一定条件下的复性速率，最后用理论推导的公式来计算DNA之间的同源性。同一菌的复性率为100%，80%~90%同源为同一种内同一亚种的细菌，60%~70%同源为同一种内不同亚种的细菌，20%~60%同源则是同一属中的不同菌种。这种方法还可对新菌种或表型性状差别很小而难以肯定的菌株做出较可靠的判定，并可修正其他方法的分类和鉴定错误。

3．16S rRNA同源性分析

(1) rRNA-DNA杂交：变性rRNA与变性DNA混合时，rRNA与其互补的DNA链形成杂交双链，rRNA分子与异源DNA杂交时，也能在其同源区形成互补双链，这种杂交双链的稳定性与其同源性成正相关，适于细菌属及属上水平的分类研究。现最常用的是硝酸纤维膜结合法。

(2)16S rRNA序列测定：rRNA分子具有高度保守性，在所有的细胞生物中都存在，在长期的进化中，16S rRNA的总碱基数有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互对齐进行比较。1985年Lane等提出了改良的Sanger双脱氧链终止法测定rRNA序列，以rRNA为模板，以一个或多个寡核苷酸链做引物（与rRNA分子上的一段保守区域互补的15~20个核苷酸），用反转录酶合成反转录DNA。随着PCR技术的成熟，出现了利用PCR技术扩增16S rRNA基因（rDNA），然后采用Sanger法分析rDNA序列的方法，该法比前者更方便。当前的细菌分类要求测定16S rRNA基因的全序列来进行比较。16S rRNA基因序列分析技术是建立系统分类的主要技术，有人建议DNA相关性≥70%，16S rRNA序列差异≤1%~1.5%的细菌属于同一种，这使细菌的种有一个稳定和统一的标准。

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