分子生物学技术在微生物检验中的应用（2）

分子生物学技术在细菌鉴定中的应用

十九世纪，细菌的鉴定主要依靠细菌的表型特征，因耗时长，往往耽误了对疾病诊断与治疗。随着分子生物学技术的发展及在临床微生物学检验中的应用，为微生物学实验室对细菌的快速鉴定，尤其是对难分离细菌的快速鉴定，提供了有利条件。目前在细菌鉴定中应用的分子生物学技术主要有核酸探针和核酸扩增技术等。

1．核酸探针技术

应用核酸探针技术检测病原微生物核酸是临床诊断学的重大发展，其原理是用带有酶、化学荧光物、放射性核素或生物素标记的已知序列特定DNA片段（称为探针），在一定条件下，按碱基互补原则探针与待测标本中的核酸杂交，通过对杂交信号的检测，从而鉴定标本中有无相应的病原微生物基因及其分子大小。常用核酸探针技术有固相杂交（斑点杂交、原位杂交、Southern印迹、Northern印迹等。）和液相杂交技术。

核酸探针适用于直接检出临床标本中的病原微生物，不受非病原微生物的影响，因此对某些尚不能分离培养或很难分离培养的微生物的检测具有重要的意义。随着探针标记的不断改进，检测试剂盒商品化，操作更简便易行。

核酸扩增技术

核酸扩增（又称基因或DNA扩增）技术是体外酶促合成DNA片段的新方法，其原理类似于DNA的体内半保留复制。主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成。即在高温下（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37~55℃）情况下，两条人式合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物的3`端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5` 3`方向延伸，合成DNA新链。这样每一双链DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使人工合成的引物间的DNA特异区段拷贝数扩增一倍。经过上述25~40个循环后，靶序列可以扩增成106~108。

核酸扩增技术（或称聚合酶链反应技术，PCR）具有高敏感性、高特异性、简便、快速等特点，临床实验室常用PCR技术来检测标本中某些微生物，尤其是对难以培养微生物的检测。其它用于检测微生物的PCR技术还有：RT-PCR、巢式PCR、多重PCR和随机引物PCR等。核酸扩增技术在临床微生物学检验中的应用见表6-4-2。

表6-4-2 核酸扩增技术在临床微生物学检验中的应用

微生物种类 核酸扩增技术 应 用

金黄色葡萄球菌 多重PCR 对mecA基因检测

凝固酶阴性葡萄球菌 多重PCR 对mecA基因检测

肺炎链球菌 PCR 自溶酶和青霉素结合酶的检测

化脓性链球菌 PCR M蛋白基因的菌株分型

淋病奈瑟菌 LCR 尿道分泌物标本直接检测

百日咳杆菌 PCR、巢式PCR 临床标本检测

结核分枝杆菌

PCR、SDA、Qbeta 肺结核的诊断、呼吸道标本检测、临床标本直接检测

鸟分枝杆菌复合群 PCR 鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的区别

白喉棒状杆菌 PCR 产毒菌株的检测

肠致病性大肠埃希菌 多重PCR 产毒菌株检测

伤寒、副伤寒沙门菌 PCR 耐药质粒分型和检测

幽门螺杆菌 多重PCR 胃活检组织细菌检测

小肠结肠炎耶尔森菌 PCR 菌株分型

弯曲菌属 PCR 通过16s rRNA鉴定

杜克雷嗜血杆菌 多重PCR 生殖道溃疡病人的直接检测

嗜肺军团菌 PCR 与爆发相关菌株的分型

金氏杆菌属 PCR 临床标本鉴定

念珠菌属 PCR 通过“DNA”指纹鉴定

梅毒螺旋体 多重PCR 生殖道溃疡标本直接检测

伯氏螺旋体 巢式PCR 治疗前、中、后检测

问号状钩端螺旋体 PCR 钩端螺旋体血清型的鉴定

CDC group Ⅳ 群 PCR 分型

沙眼衣原体 PCR 无症状病人的诊断

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