实验目的
1．通过了解不同细菌对不同的生物大分子分解利用情况，从而认识微生物代谢类型多样性。
2．进一步学习平板接种法及穿刺接种法。
实验内容
学习微生物对生物大分子的分解利用能力的测定方法。
实验原理
微生物在生长繁殖过程中，需从外界环境吸收营养物质。外界环境中的小分子有机物质可被微生物直接吸收，而大分子有机物则不能被微生物直接吸收，它们须经微生物分泌的胞外酶将其分解为小分子有机物，才能被吸收利用。例如生物大分于中的淀粉、蛋白质、脂肪等须经微生物分泌的胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶分别分解为糖、肽、氨基酸、脂肪酸等之后，才能被微生物吸收而进入细胞。
不同微生物分解利用生物大分子能力各有不同。只有那些能够产生并分泌跑外酶的微生物才能利用大分子有机物。
现分别介绍淀粉水解、油脂水解、明胶液化和石蕊牛乳等试验的简单原理。
1．淀粉水解试验
某些细菌能够分泌淀粉酶（胞外酶），将淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。淀粉被水解后遇碘不再变蓝色。
2．油脂水解试验
某些细菌能够分泌脂肪酶 （胞外酶），能将培养基中的脂肪水解为甘油和脂肪酸。所产生的脂肪酸，可通过预先加入油脂培养基中的中性红加以指示[指示范围 pH6.8（红）～pH 8.0（黄）。当细菌分解脂肪产生脂肪酸时，培养基中出现红色斑点。
3．明胶液化试验
明胶是一种动物蛋白。明胶培养基本身在低于 20℃时凝固，高于 25℃则自行液化。某些细菌能够产生蛋白酶（胞外酶），将明胶水解成小分子物质，因此培养后的培养基即使在低于20℃的温度下，明胶也不再凝固，而由原来的固体状态变为液体状态。
4．石蕊牛乳试验
牛乳中主要含有乳糖和酪蛋白。细菌对牛乳的利用主要是指对乳糖及酪蛋白的分解利用。牛乳中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性时呈蓝色，还原时则部分或全部褪色变白。
细菌对牛乳的作用有以下几种情况：
（1）产酸 细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红。
（2）产碱 细菌分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝。
（3）胨化 细菌产生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛乳变成清亮透明的液体。
（4）酸凝固 细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红，当酸度很高时，可使牛乳凝固。
（5）凝乳酶凝固 细菌产生凝乳酶，使牛乳中酪蛋白凝固，此时石蕊呈蓝色或不变色
（6）还原 细菌生长旺盛时，使培养基氧化还原电位降低．因而石蕊被还原而褪色。
实验器材
枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、粘乳产碱菌、铜绿假单胞菌。
淀粉培养基、油脂培养基、明胶液化培养基、石蕊牛乳培养基。
试管、三角瓶、培养皿、接种针、接种环等。
碘液等。
实验步骤
1．淀粉水解试验
(1) 将装有淀粉培养基的锥形瓶置于沸水浴中融化，然后取出冷却至 50℃左右，即倾入培养皿中，待凝固后制成平板。
(2) 翻转平板使底皿背面向上，用记号笔在其背面玻璃上划成两半，—半用于接种枯草芽孢杆菌作为阳性对照菌，另一半用于接种试验菌大肠杆菌或产气肠杆菌。接种时用接种环取少量菌在平板两边各划“十”字。
(3) 将接完种的平板倒置于 37℃恒温箱中，培养 24h。
(4) 观察结果时，可打开皿盖，滴加少量碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。如菌体周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱。
2．油脂水解试验
(1) 将装有油脂培养基的锥形瓶置于沸水浴中融化，取出并充分振荡 （使油脂均匀分布），再倾入培养皿中，待凝固后制成平板。
(2) 翻转平板使底皿背面向上，用记号笔在其背面玻璃上划成两半。一半用于接种金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌，另一半用于接种实验菌大肠杆菌或产气肠杆菌。接种时用接种环取少量菌在平板两边各划线接钟。
3) 将接种完的平板倒置于 37℃恒温箱中，培养 24h。
(4) 观察结果时，注意观察平板上长菌的地方，如出现红色斑点，即说明脂肪已被水解，此为阳性反应。
3．明胶液化试验
(1) 用穿刺接种法分别接种大肠杆菌或产气肠杆菌于明胶培养基中。
(2) 接种后置于 20℃恒温箱中，培养 48h。
(3) 观察结果时，注意培养基有无液化情况及液化后的形状。
4．石蕊牛乳试验
(1) 分别接种粘乳产碱菌或铜绿假单胞菌于二支石蕊牛乳培养基中，置于 37℃恒温箱中培养 7d。另外保留一支不接种石蕊牛乳培养基作对照。
(2) 观察结果时，注意牛乳有无产酸、产碱、凝固或胨化等反应。注意牛乳产酸、产碱、凝固、胨化各现象是连续出现的，往往观察某种现象出现时，另一种现象已经消失了。
实验结果及讨论
1．实验结果
(1) 记录细菌对生物大分子分解利用的各项实验及其结果。
(2) 淀粉、油脂、明胶和酪蛋白等生物大分子物质能否不经分解而直接被细菌吸收？为什么？
(3) 明胶液化试验中，为什么只能将接种后的培养基置于 20℃温箱中培养？
2．讨论
针对实验原理、步骤、现象进行讨论。
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