植物组培的操作技术：初代培养

培养

指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件）里，使之生长，分裂、分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。

（一）培养方法

1．固体培养法

即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。该法设备简单，易行。但养分分布不均，生长速度不均衡。并常有褐化中毒现象发生。

2．液体培养法

即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50～100转／min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。

（二）培养步骤

1．初代培养

   即接种某种外植体后，最初的几代培养。初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。根据初代培养时发育的方向可分为：

（1）顶芽和腋芽的发育

采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长。形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽－苗增殖的培养，从而迅速获得多数的嫩茎。然后将一部份嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少数草本植物可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微型扦插，它不经过发生愈伤组织而再生，是最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。

适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其它如种子萌发后取枝条也可以。

茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。在实际操作中。采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养，这是为了操作方便以及容易成活。

用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛。

   （2）不定芽的发育

在培养中由外植体产生不定芽,通常首先要经脱分化过程,形成愈伤组织的细胞。然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性（这与胚状体不同）。多数情况下它先形成芽，后形成根。

另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是连续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。许多常规方法不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。

在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。

（3）体细胞胚状体的发生与发育

    体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。但它是由体细胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面发生，也可从外植体表面已分化的细胞产生，或从悬浮培养的细胞产生。

(4)初代培养外植体的褐变

外植体褐变是指在接种后，其表面开始变褐，有时甚至会使整个培养基变褐的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。

褐变的主要原因如下：

（1）花卉品种：研究表明，在不同花卉品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异，因此有些花卉品种的外植体在接种后较易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不易褐变。故在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。

（2）生理状态：外植体的生理状态不同，在接种后褐变程度也有所不同。一般来说，处于同期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。

（3）培养基成分：浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些花卉外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。

（4）培养条件不当：例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。

为了提高花卉组织培养的成苗率，必须对外植体的褐变现象加以控制。经过众多研究者的努力，可以采用措施防止、减轻褐变现象的发生。

（1）选择合适的外植体：一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。

（2）合适的培养条件：无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。

（3）使用抗氧化剂：在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外使用0．1％～0．5％的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。

（4）连续转移：对容易褐变的材料可间隔12～24小时的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7～10天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。  

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