实验：革兰氏染色法

实验目的 

1．学习并初步掌握革兰氏染色法。 

2．了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 

实验内容 

1．制作细菌染色装片。 

2．分别对单菌和混菌进行革兰氏染色法操作。 

实验原理 

    用于生物染色的染料主要有碱性染料、 酸性染料和中性染料三大类。 碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基 pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 

    革兰氏染色法是 1884年由丹麦病理学家 C.Gram所创立的。 革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 

    该染色法所以能将细菌分为 G+菌和 G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色， 再经蕃红复染后就成红色。G+  菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高， 类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 

实验器材 

    培养 12-16h的枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养 24 小时的大肠杆菌（Escherichia coli） 

    结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红、液体石蜡、擦镜液 

    载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。 

实验步骤 

一、单菌的革兰氏染色： 

    分别取枯草杆菌、大肠杆菌进行革兰氏染色。 

1．制片： 

(1) 涂菌：取干净载玻片一块，在载玻片上加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，注意取菌不要太多。 

(2) 干燥：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 

(3)固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰 2-3次固定（以不烫手为宜）

2．染色 

(1) 初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色 1～2min，水洗。 

(2) 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约 1min，水洗。 

(3) 脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加 95％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 

(4) 复染：用番红液复染约 2min，水洗。 

3．镜检：干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。 

二、混菌的革兰氏染色： 

    按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌作混和涂片、染色、镜检进行比较。 

实验结果及讨论 

1．实验结果 

    列表简述 2株细菌的染色观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应），分别绘制单菌及混菌的染色结果。 

2．讨论 

    针对实验原理、步骤、现象进行讨论。 

实验作业 

1．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 

2．进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？ 

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